アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)のチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる
染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of Bis(2-ethylhexyl) azelate
in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU細胞)を用いて染色体異常試験を実施した．

染色体異常試験に用いる濃度を決定するため，4200 μg/mL(10 mM相当)を最高濃度として細胞増殖抑制試験を行った結果，50 %細胞増殖抑制濃度は，短時間処理法のS9 mix添加では1859.0 μg/mL，S9 mix無添加では1555.5 μg/mLであった．一方，連続処理法(24時間)では534.2 μg/mLであった．このことから試験濃度は，短時間処理法のS9 mix添加および無添加では2400 μg/mL，連続処理法では600 μg/mLを最高濃度とし，公比2で5濃度設定した．また，媒体として無水エタノールを用いたため，無処置対照を設け，試験系に及ぼす無水エタノールの影響を検討した．

試験の結果，短時間処理法ならびに連続処理法のいずれの処理群においても，染色体の構造異常，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．また，媒体として用いた無水エタノールは無処置対照群と同様な値を示し，試験系に及ぼす影響は認められなかった．

以上の結果より，アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は，上記の試験条件下で染色体異常を誘発しない(陰性)と判定する．

方法

1．被験物質

アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)(ロット番号: N-31101，大八化学工業，大阪)は，淡黄色透明液体で水，DMSOに不溶，アセトン，メタノール，エタノールに可溶で，通常の取り扱いにおいては安定，純度77.2%の物質である．被験物質は室温で保管した．

被験物質は無水エタノール(ワコーケミカル)に用時溶解して最高濃度原液を調製し，その後，無水エタノールで順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を調製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の1.0 vol%になるように加えた．なお，純度換算は，製法上純粋なものができないことから行わなかった．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

2．試験細胞株

大日本製薬から入手したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

3．培養液の調製

Eagle-MEM粉末(GIBCO)を常法に従い調製し，非働化(56℃，30分)した仔牛血清(GIBCO)を最終濃度で10 vol%になるように加えた培養液を用いた．

4．培養条件

2×104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm，CORNING)に播き，37℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．

短時間処理法では，細胞播種3日後に被験物質を加え，S9 mix添加および無添加で6時間処理し，処理終了後，新鮮な培養液でさらに18時間培養した．また，連続処理法では，細胞播種3日後に被験物質を加え，24時間処理した．

5．S9

S9(オリエンタル酵母工業)は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製され，製造後6ヵ月以内のものを用いた．添加量は培養液に対して5 vol%とした．

6．細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，血球計測盤を用いて各群の細胞を計測し，陰性(溶媒)対照群に対する割合をもって指標とした．

その結果，50 %細胞増殖抑制濃度は，短時間処理法のS9 mix添加では1859.0 μg/mL，S9 mix無添加では1555.5 μg/mLであった．一方，連続処理法(24時間)では534.2 μg/mLであった(Fig.1)．

7．実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果により，染色体異常試験は，短時間処理法のS9 mix添加および無添加では2400 μg/mL，連続処理法では600 μg/mLを最高濃度とし，公比2で5濃度設定した．対照として，陰性(媒体)対照，無処置対照および陽性対照を設けた．

陽性対照として，短時間処理法のS9 mix添加には，ジメチルニトロサミン(DMN，和光純薬工業)を500 μg/mL，S9 mix無添加には，マイトマイシンC(MMC，協和醗酵工業)を0.1 μg/mL，連続処理法には，MMCを0.05 μg/mLの濃度で用いた．

いずれの処理群も，各濃度3枚のディッシュに処理し，2枚を染色体標本作製，1枚を細胞増殖計測用に用いた．

8．染色体標本の作製

培養終了2時間前にコルセミド(GIBCO)を最終濃度として約0.2 μg/mLとなるように添加した．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき3枚作製した．作製した標本を2 vol%ギムザ染色液で15分間染色した．

9．染色体の観察

各ディッシュ当たり100個，すなわち1濃度当たり200個の分裂中期像を顕微鏡下で観察した．標本はすべてコード化し，盲検法で観察を行った．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会による分類法1)に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型の切断，交換などの構造異常と倍数性細胞の有無について観察した．

10．結果の解析

構造異常を有する細胞あるいは倍数性細胞の出現頻度を，石館ら2)の基準に従って判定した．染色体異常を有する細胞の出現頻度が5 %未満を陰性(-)，5 %以上10 %未満を疑陽性(±)，10 %以上を陽性(+)とした．

なお，構造異常はギャップのみを有する細胞を含めない(-gap)場合について判定した．

また，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

短時間処理法による試験結果をTable 1に示した．アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)をS9 mix添加および無添加で6時間処理したいずれの処理群とも，染色体の構造異常および数的異常の誘発性は認められなかった． また，S9 mix添加における陽性対照のDMN処理およびS9 mix無添加における陽性対照のMMC処理では，いずれの処理群とも染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．

連続処理法による試験結果をTable 2に示した．アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)を24時間連続処理した群においても，染色体の構造異常および数的異常の誘発性は認められなかった．また，陽性対照のMMC処理では，いずれの処理群とも染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．

短時間処理法および連続処理法とも，媒体として用いた無水エタノールは，無処置対照群と同様な結果を示し，試験系に及ぼす影響は認められなかった．

以上の結果から，アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は本試験条件下において，染色体異常誘発性はない(陰性)と判定する．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(編):「化学物質による染色体異常アトラス」朝倉書店，東京(1988)pp.16-37．
2)石館 基(監修):「〈改定〉 染色体異常試験データー集」エル・アイ・シー，東京(1987)．

連絡先
試験責任者：三輪芳久
試験担当者：小林梨沙
（株）日本バイオリサーチセンター　羽島研究所
〒501-6251　岐阜県羽島市福寿町間島6-104
Tel 058-392-6222Fax 058-392-1284

Correspondence
Authors:Yoshihisa Miwa(Study director)
Risa Kobayashi
Nihon Bioresearch Inc.
104, 6-chome, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan.
Tel +81-58-392-6222Fax +81-58-392-1284