アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)の細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of Bis(2-ethylhexyl) azelate in Bacteria

要約

アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)について，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰変異試験を実施した．

用量設定試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix無添加および添加の場合とも，いずれの菌株も312.5〜5000 μg/plateを公比2で5濃度を設定した．

2回の本試験の結果，S9 mix無添加のおよび添加のいずれの濃度においても，復帰変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上に増加しなかった．

以上の結果から，アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は本試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と結論する．

方法

1．被験物質

アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)(ロット番号: N-31101，大八化学工業，大阪)は，淡黄色透明液体で水，DMSOに不溶，アセトン，メタノール，エタノールに可溶で，通常の取り扱いにおいては安定，純度77.2 %の物質である．被験物質は室温で保管した．

被験物質は無水エタノール(ワコーケミカル)に用時溶解して最高濃度原液を調製し，その後，無水エタノールで順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を調製した．なお，純度換算は，製法上純粋なものができないことから行わなかった．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

2．陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを用いた．
2AA:2-アミノアントラセン(SIGMA)
NaN3:アジ化ナトリウム(ナカライテスク)
9AA:9-アミノアクリジン(ナカライテスク)
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業)
NaN3は注射用水に，その他はDMSOに溶解したものを使用した．

3．試験菌株

Salmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA15371)およびEscherichia coli WP2 uvrA2)の5菌株を用いた．これら5菌株は，日本バイオアッセイ研究センターから分与された．試験菌株は，超低温フリーザー(-80 ℃)で凍結保存したものを使用した．これら菌株はアミノ酸要求性，紫外線感受性，膜変異，薬剤耐性などの遺伝的特徴を事前に調べ，特性を備えていることを確認した．

試験に際して，L字型試験管にニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2)溶液を10 mL分注し，これに凍結保存した菌懸濁液を融解して20 μLを接種した．37 ℃で8時間振盪培養した後，濁度計を用いて濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式から1 mLあたり生菌数が1×109以上であることを確認した．

4．培地およびS9 mixの組成

1)　トップアガー

注射用水100 mLに対して，Bacto Agar(DIFCO)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，高圧蒸気滅菌し完全に溶解させた後，S. typhimuriumの場合には0.5 mmol/L L-ヒスチジンと0.5 mmol/L D-ビオチンを混合した水溶液を，E.coliの場合には0.5 mmol/L L-トリプトファン水溶液を10:1の割合で加えて調製した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天15 g
培地は，径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．

3)　S9 mix

S9(オリエンタル酵母工業)は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製され，製造後6ヵ月以内のものを用いた．S9 mixは，S9mix用のCofactor(Cofactor-，オリエンタル酵母工業)を注射用水で溶解して，使用直前にS9 を加えて調製した．

S9 mix 1 mLあたりの組成は下記のとおりである．

S90.1 mL
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
β-NADPH4 μmol
β-NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH7.4)100 μmol
注射用水残量

5．試験方法

試験はプレインキュベーション法で実施した．
乾熱滅菌した試験管に被験物質調製液，媒体対照(無水エタノール)，陰性対照(注射用水)0.05 mL，または陽性対照0.1 mL，0.1 mol/L Na-リン酸緩衝液(pH7.4)0.5 mL(S9 mix無添加)，またはS9 mix 0.5 mL (S9 mix添加)，菌懸濁液0.1 mLの順に加え，37 ℃で20分間振盪培養した．その後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加え混和し，最少グルコース寒天平板培地上に播き広げ，トップアガーが凝固した後，プレートを転倒して37 ℃で48時間培養した．

培養終了後，被験物質による菌の生育阻害を調べるため，実体顕微鏡(×100)を用いて菌の生育状態を観察した．また，目視により被験物質の析出の有無を確認した．復帰変異コロニー数は，自動コロニーカウンターにより計測した．用量設定試験は各濃度につき1枚のプレートを使用した．本試験は各濃度につき3枚のプレートを使用し，再現性を確認するため2回実施した．

6．結果の判定基準

被験物質における復帰変異コロニー数が，媒体対照の2倍以上の値を示し，濃度に依存して増加し，さらにその増加に再現性が認められた場合に，変異原性を有する(陽性)と判定した．なお，結果の判定には統計学的手法は用いなかった．

結果および考察

1．用量設定試験

用量設定試験を1.22，4.88，19.5，78.1，312.5，1250，5000 μg/plate の7濃度で実施した結果，S9 mix無添加および添加の場合とも，いずれの菌株においても，菌の生育阻害および復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．なお，S9 mix無添加および添加の場合とも，78.1 μg/plate以上の濃度において，無色透明の微細な油滴状の析出物および油膜状の析出物が認められた．従って，本試験ではS9 mix無添加および添加の場合とも，いずれの菌株も312.5〜5000 μg/plateを公比2で5濃度を設定した．

2．本試験(Table 1〜4)

2回の本試験の結果，S9 mix無添加および添加の場合とも，いずれの菌株においても，溶媒対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

S9 mix無添加および添加の場合とも，すべての濃度において無色透明の微細な油滴状の析出物および油膜状の析出物が認められた．

なお，S9 mix無添加および添加において陽性対照が各菌株に誘発した復帰変異コロニー数は，各菌株の媒体対照の復帰変異コロニー数と比較して，明らかに2倍以上に増加し，陽性結果を示した．また，媒体として用いた無水エタノールの復帰変異コロニー数は，いずれの菌株も陰性対照(注射用水)における値と同様であり，試験系に及ぼす影響は認められなかった．

以上の結果から，アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は本試験条件下において，変異原性を有しないもの(陰性)と判定する．

文献

1)Maron DM, Ames BN: Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res, 113: 173-215(1983)．
2)Green MHL, Muriel WJ: Mutagen testing using trp+ reversion in Escherichia coli. Mutation Res, 38, 3-32(1976)．

連絡先
試験責任者：三輪芳久
試験担当者：永澤佳子，小林梨沙
（株）日本バイオリサーチセンター　羽島研究所
〒501-6251　岐阜県羽島市福寿町間島6-104
Tel 058-392-6222Fax 058-392-1284

Correspondence
Authors:Yoshihisa Miwa(Study director)
Yoshiko Nagasawa,Risa Kobayashi
Nihon Bioresearch Inc.
104, 6-chome, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan.
Tel +81-58-392-6222Fax +81-58-392-1284