アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)のラットを用いる単回経口投与毒性試験

Single Dose Oral Toxicity Test of Bis(2-ethylhexyl) azelate in Rats

要約

アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は,溶剤・界面活性剤,化学合成原料あるいは合成潤滑油として用いられている化合物である1).本化学物質の毒性に関しては,ラットおよびウサギを用いた急性毒性試験が実施されており1),ラットにおける経口投与による50 %致死量はは8720 μL/kgと報告されている2).今回,OECDによる既存化学物質安全性点検に係る毒性調査の一環として,アゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)の0(媒体対照,コーン油 5 mL/kg)および2000 mg/kgを,5週齢のSprague-Dawley系[Crj:CD(SD)IGS]雌雄ラット各5匹/群に単回経口投与し,急性経口投与毒性試験を実施した.投与日(観察第1日)から14日間観察を行い,その間,体重を測定して対照群と比較し,観察第15日に屠殺して剖検した結果,15日間の観察期間中に死亡例はなく,被験物質投与に起因した一般状態の異常も認められなかった.さらに,体重増加にも被験物質投与の影響はみられず,剖検においても異常所見は認められなかった.

以上の結果から,2000 mg/kgのアゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)をラットに単回経口投与しても影響は認められないと結論された.

方法

1.被験物質および投与検体の調製

本試験に使用した被験物質のアゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)は,大八化学工業(大阪)より提供を受けたもの(ロット番号:N-31101)で,純度は77.2 %で,不純物として,グルタル酸ビス2-エチルヘキシル(2.2 %),アジピン酸ビス2-エチルヘキシル(2.4 %),ピメリン酸ビス2-エチルヘキシル(2.8 %),スベリン酸ビス2-エチルヘキシル(3.8 %),セバシン酸ビス2-エチルヘキシル(3.3 %),1-,9-ノナメチレンジカルボン酸ビス2-エチルヘキシル(5.3 %),1-,10-デカメチレンジカルボン酸ビス2-エチルヘキシル(0.6 %),1-,11-ウンデカメチレンジカルボン酸ビス2-エチルヘキシル(0.3 %)を含む.被験物質は入手後,使用時まで密封して室温で保管し,被験物質の試験期間中の安定性を,残余入手物質を提供元で再分析することにより確認した.

被験物質は水に不溶であることから,投与検体の調製には媒体としてコーン油(ロット番号:V2E7069,ナカライテスク)を選択し,被験物質の純度補正を行わずに,必要量の被験物質を秤量し,所定濃度となるように媒体に溶解して調製した.投与に先立ち,0.4および50 %(w/v)の調製検体について室温・遮光条件下における8日間の安定性を秦野研究所において確認したので,調製した投与検体は使用時まで室温で保存した.投与検体中に含まれる被験物質の含量は,秦野研究所において確認した.

2.使用動物および飼育方法

4週齢のSprague-Dawley系[Crj:CD(SD)IGS, SPF]雌雄ラットを,日本チャールス・リバー厚木飼育センターから購入し,飼育環境への馴化と検疫を兼ねて6日間予備飼育した.これらの動物は検疫終了時の体重を基に体重別層化無作為抽出法により雌雄各2群に分けて,各群に5匹を配した.投与開始時の週齢は,雌雄ともに5週齢であり,体重は雄が109.2〜119.5 g,雌が85.5〜97.4 gであった.

動物は,基準温湿度各21.0〜25.0℃および40.0〜75.0 %,換気回数約15回/時間,照明12時間(7-19時点灯)に制御された飼育室で,金属製金網床ケ−ジに個別に収容し,固型飼料(CE-2,日本クレア)および飲料水(水道水,秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した.

3.投与量の設定および投与方法

本試験における投与量は,本試験に先立ち実施した予備試験の結果に基づいて決定した.すなわち,文献検索の結果,被験物質のラット経口投与時の50 %致死量は8720 μL/kgであった1)ことから,本試験に使用するのと同系統および同週齢の雌雄ラット各3匹に,絶食下で1500,2000,および2500 mg/kgを単回投与し(観察第1日),観察第8日まで生死および一般状態を観察し,体重を測定した.その結果,雌雄ともに,いずれの投与群においても観察終了日まで死亡する例はなく,2000 mg/kg以下の投与群では一般状態にも変化は認められなかった.2500 mg/kg投与群では,雌雄ともに投与後6時間以降,翌朝までに,粘液便あるいは軟便が観察されたが,観察第3日以降には認められなかった.これらの結果から,本試験ではOECD化学物質試験法ガイドラインに定める限度試験を実施することとし,2000 mg/kgの1群および媒体(コーン油)投与群を設けた.

投与容量は体重1 kg当たり5 mLとし,動物を投与前日の16時より絶食させた後,投与直前に測定した体重を基に投与液量を算出し,ラット用胃管を用いて強制的に単回経口投与した.給餌は投与後約3時間に行った.

4.観察および検査

1) 一般状態観察

観察第1日(投与日)から14日間にわたって死亡の有無を確認し,各動物の一般状態を観察した.観察は投与日においては投与直後から1時間まで連続して行い,その後は投与後6時間まで約1時間間隔で実施した.観察第2〜6日は1日2回,その後は毎日1回観察した.

2) 体重測定

全例について,投与日の投与直前,観察第2,4,8,11および15日に測定した.

3) 剖検

観察第15日にペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血・致死させてから剖検し,脳,下垂体,眼球,甲状腺,心臓,気管,肺,肝臓,腎臓,胸腺,脾臓,副腎,消化管,生殖器,乳腺,膀胱,下顎リンパ節,腸間膜リンパ節,大腿骨骨髄,膵臓,顎下腺,舌,食道,大動脈,ハーダー腺,皮膚および病変部の肉眼的観察を実施した.

5.データの解析

体重について群ごとに平均値と標準偏差を雌雄別に求めた.さらに対照群と被験物質投与群の間でF-検定を行い,等分散の場合はStudentのt検定を用い,不等分散の場合はAspin-Welch検定を用い,対照群と被験物質投与群との平均値の差を検定した.いずれの検定においても有意水準は5 %とした.

結果

1.死亡状況および一般状態

雌雄ともに死亡動物はみられなかった.

投与後1〜6時間の間に対照群の雄4例および雌2例に軟便が観察されたが,被験物質投与群では雌雄ともに投与後の一般状態に変化は認められなかった.

2.体重

雌雄ともに体重推移に被験物質投与群と対照群との間で有意差は認められなかった.

3.病理学検査

対照群の雄の一例において,右側の腎臓に小嚢胞の散在が観察されたが,被験物質投与群では雌雄ともに異常所見は認められなかった.

考察

2000 mg/kgのアゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)を投与しても死亡例はなく,瀕死状態に至る例もなかった.また,投与後の一般状態も,コーン油投与による軟便が対照群の動物に認められたのみで,被験物質投与による影響は認められなかった.病理学検査においても対照群の腎臓に小嚢胞が観察されたのみで,被験物質投与群に異常は観察されなかった.従って,本試験条件下において2000 mg/kgのアゼライン酸ビス(2-エチルヘキシル)の単回経口投与は,雌雄ラットに対して影響を及ぼさないと結論された.

文献

1)化学物質データベース.Kis-NET,番号2603,国立環境研究所(2003).
2)Smyth HF Jr, Carpenter CP, Weil CS, Pozzani UC, Striegel JA: Range-finding toxicity data: List VI. Am Ind Hyg Assoc J, 23, 95-107(1962).

連絡先
試験責任者:代田眞理子
試験担当者:渡辺千朗
(財)食品薬品安全センタ−秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Mariko Shirota(Study director)
Chiaki Watanabe
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627