1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸の
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of 1,3,5-Tris(2-propenyl)isocyanuric acid
in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後 18時間の回復時間)において，50 %増殖抑制濃度はそれぞれ1.5 mg/mLおよび2.0 mg/mLとなった．また，連続処理(24時間処理)した場合，50 %増殖抑制濃度は1.0 mg/mLとなった．

したがって，染色体異常試験では，短時間処理では，2.5 mg/mL(10 mM)を最高処理濃度とし，公比2で5濃度を設定した．また，S9 mix存在下で短時間処理した場合，構造異常および倍数性細胞共に誘発されるという報告があることから，濃度設定を変更し，5濃度(0.50，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL)を設定し，再試験を行った．連続処理では，2.0 mg/mLを最高処理濃度とし，公比2で5濃度を設定した．

細胞増殖率および分裂指数より，短時間処理では，0.63，1.3，2.5 mg/mLについて，S9 mix存在下で短時間処理した2回目の試験では1.5，2.0，2.5 mg/mLについて，連続処理では，0.25，0.5，1.0 mg/mLについて染色体分析を行った．

染色体分析の結果，S9 mix非存在下で短時間処理した場合，1.3 mg/mL(中濃度群)および2.5 mg/mL(高濃度群)で染色体構造異常の有意な増加が認められた(4.0 %および4.5 %)が．その出現率が低頻度であることから，生物学的には陰性であると判断した．また，倍数性細胞については，S9 mix非存在下で短時間処理した1.3 mg/mL(中濃度群)において有意な増加が認められたが，その出現率が1.0 %と低かったことから陰性であると判定した．

S9 mix存在下で短時間処理した場合には，構造異常および倍数性細胞の誘発についてはいずれの処理群でも有意な増加は認められなかった．また，濃度を変えて行った2回目の試験でも，いずれの処理群においても，構造異常を有する細胞および倍数性細胞の統計学的な有意差を認められなかった．

連続処理では，いずれの処理群においても，構造異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下で1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸は，染色体異常を誘発しない(陰性)と結論した．

方法

1.　細胞

CHL/IU 細胞はチャイニーズ・ハムスター，肺由来で，リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21および23代)した．試験には，解凍後継代10代以内で試験に用いた．仔牛血清(CS，Cansera International)を10 vol%添加したイーグル MEM(日水製薬)培養液を用い，CO2 インキュベーター(37℃ ，5 % CO2)内で培養した．

2.　S9 mix

S9(キッコーマン)は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．S9 mixは処理培地に10 vol%添加し，各成分の最終濃度はS9 5 vol%，グルコース6リン酸(Sigma Chemical)0.83 mmol/L，β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(オリエンタル酵母工業)0.67 mmol/L，MgCl2 0.83 mmol/L，KCl 5.5 mmol/L，HEPES 緩衝液(pH 7.2)0.67 mmol/Lとした．

3.　被験物質

1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸(ロット番号:10011003，日本化成(東京))は，純度99.12 %の淡黄色液体または白色固体であり，冷暗所で保管した．本物質は水に対しては50 mg/mL未満の溶解性を示し，DMSOには507 mg/mL以上の溶解性を示した．

4.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:DWL9370，和光純薬工業)を用いて原液を調製した．ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の1 vol%になるように加えた．なお，被験物質を溶媒に懸濁させた際，発熱，発泡，変色などの変化はなかった．

5.　培養条件

2×104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたガラスディッシュ(径6 cm)に播き，CO2インキュベーター内で3日間培養した．その後，連続処理では，新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，血清入りの培地によりS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

6.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．培養終了後，細胞を10 vol%ホルマリン水溶液で固定し，0.1 w/v%クリスタルバイオレット水溶液で染色した．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，コールターカウンター(Model D，Coulter Electronics)を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果， S9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合，50 %細胞増殖抑制濃度はそれぞれ1.5 mg/mLおよび2.0 mg/mLとなった．また，連続処理における50 %細胞増殖抑制濃度は1.0 mg/mLとなった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群は，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では，2.5 mg/mL(10 mM)を最高濃度とし，公比2で5濃度設定した(0.16〜2.5 mg/mL)．2回目のS9 mix 存在下における短時間処理では，2.5 mg/mL を最高濃度とし，公差0.5で5濃度設定した(0.50〜2.5 mg/mL)．連続処理では，2.0 mg/mLを最高濃度として，公比2で計5濃度を設定した(0.13〜2.0 mg/mL)．

また，陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MMC，協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CP，Sigma Chemical)は，日局注射用水(大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験において，溶媒対照群と処理群では1濃度あたり2枚のディッシュを用いた．このうちの2枚は染色体標本を作製し，それぞれの一部を用いてコールターカウンターにより細胞増殖率を測定した．無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わなかった．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本は3 vol%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率と分裂指数を細胞毒性の指標として，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1〜3)，観察可能な最高濃度は，短時間処理では，S9 mix 非存在下における2回目の短時間処理を含めすべての処理群で2.5 mg/mL，24時間処理では1.0 mg/mLであったことから，この濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　判定

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸を加えてS9 mix非存在下で短時間処理した場合には，1.3 mg/mL(中濃度群)および2.5 mg/mL(高濃度群)で有意に増加が認められたが，その出現率は4.0 %および4.5 %であることから陰性であると判断した(Table 1)．倍数性細胞については，1.3 mg/mL(中濃度群)で 有意な増加が認められたが，その出現率は1.0 %と低いことから陰性であると判断した(Table 1)．一方，S9 mix存在下で短時間処理した場合には，いずれの処理群においても染色体の構造異常を有する細胞および倍数性細胞の誘発は認められなかった(Table 2)．また，S9 mix存在下で短時間処理した2回目の結果についても，いずれの処理群についても構造異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった(Table 4)．

24時間連続処理においては，いずれの処理群においても染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった(Table 3)．

陽性対照物質として用いたMMCは，S9 mix非存在下で短時間処理および24時間連続処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1，2)，CPはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 3)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

なお，被験物質は，S9 mix 存在下で短時間処理した場合，染色体の構造異常および倍数性細胞を誘発することが報告されている4)．このことから，当該試験ではS9 mix 存在下での短時間処理を2回実施したが，いずれも陰性の結果となった．祖父尼4)のデータでは，出現率にばらつきはあったが，再現性のある陽性結果が得られていた．試験に使用した細胞や試験条件および処理濃度にほとんど差がないことから，これらの差違が何に起因するかは不明であるが，試験に使用した被験物質の不純物が影響した可能性も考えられた．

また，被験物質は，細菌を用いる復帰変異試験で陰性の結果が得られている5)．また，関連物質である1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸については，当該試験と並行して実施した染色体異常試験で，構造異常に関して陰性，倍数性細胞誘発に関しては陽性の結果が得られている5)．

以上の結果より，1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸は，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(編):「化学物質による染色体異常アトラス」朝倉書店，東京 (1988)pp. 16-37．
2)吉村　功(編):「毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ」サイエンティスト，東京 (1987)pp. 76-78．
3)吉村　功，大橋靖夫(編):「毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析」地人書館，東京 (1992)pp. 218-223．
4)祖父尼俊雄(監修):「染色体異常試験データ集」改定1998年版，エル・アイ・シー，東京 (1999)pp. 449-500．
5)原　巧 ら：1,3,5-トリス (2-プロペニル) イソシアヌル酸の細菌を用いる復帰変異試験．化学物質毒性試験報告，11：472-476(2004)．

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，高橋俊孝，若栗　忍，
中川ゆづき，橋本恵子，三枝克彦，
加藤初美
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Kohji Yamakage,
Toshitaka Takahashi,
Shinobu Wakuri, Yuzuki Nakagawa,
Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa,
Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627