グリセリン三酢酸エステルのラットを用いる
反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験
Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test of
Glycerol triacetate by Oral Administration in Rats
要約
グリセリン三酢酸エステルは短鎖脂肪酸エステルで，アセテート繊維用可塑剤，食品添加物，化粧品工業における香料の固定剤などの製造に使用され，その他に医療分野では局所殺菌剤，また最近では非経口栄養剤への利用が検討されている１）．毒性に関する情報としては，眼に対して刺激があり２），ラットの皮下投与によるLD50値は3.25 g/kg３），また経口投与では6.4-12.8 g/kgとの報告がある４）．今回，OECDによる既存化学物質の安全性点検に係わる毒性調査事業の一環として，SDラット(1群雌雄各12匹)に40，200および1000 mg/kgの用量を交配前14日から交配を経て雄は計44日間，雌は妊娠，分娩を経て哺育3日まで経口投与し，反復投与毒性および生殖発生毒性について検討した．
1. 反復投与毒性
一般状態，体重および摂餌量に被験物質の影響は認められなかった．また，剖検，器官重量，病理組織学検査，雄の血液学検査および血液生化学検査のいずれにおいても被験物質に起因する変化は認められなかった．
2. 生殖発生毒性
親動物の交尾率，受胎率，黄体数，着床数，着床率，分娩率，出産率，妊娠期間，分娩および哺育行動には被験物質に起因する変化は認められなかった．また，出産児数，出産生児数，性比，出生率，新生児の4日生存率，外表，一般状態，体重および剖検のいずれにおいても被験物質に起因する変化は認められなかった．
以上の結果より，グリセリン三酢酸エステルの反復投与毒性に関する無影響量は雌雄とも1000 mg/kg/day，生殖発生毒性に関する無影響量についても親動物および児動物ともに1000 mg/kg/dayと考えられる．
方法
1. 被験物質
グリセリン三酢酸エステル(大八化学工業
，Lot No. N-80302，純度98.2 %)は，凝固点-62℃，沸点258℃，比重1.161，水にわずかに溶け，アセトンおよびDMSOに溶けやすい，無臭または微かな臭いがある無色透明の液体である．被験物質は室温・暗所で保管した．また，試験期間中安定であったことが確認された．
2. 試験動物および飼育条件
日本チャールス・リバーから入手した雌雄のSDラット〔Crj:CD(SD)IGS〕を6日間検疫・馴化後，試験に供した．投与開始前日に体重別層化無作為抽出法により，1群につき雌雄各12匹を振り分けた．投与開始時の週齢は雌雄とも9週齢，体重範囲は雄が317〜375 g，雌が203〜240 gであった．
検疫・馴化期間を含めた全飼育期間中，温度22±2℃，湿度55±15 %，換気約12回/時，照明12時間/日(7:00〜19:00)に設定した飼育室を使用した．動物は実験動物用床敷(ベータチップ:日本チャールス・リバー)を敷いたポリカーボネート製ケージに，群分け後は1匹，交配期間は雌雄各1匹，哺育期間は1腹で収容し，飼育した．
動物には，オートクレーブ滅菌した実験動物用固型飼料(CRF-1:オリエンタル酵母工業)および5 μmのフィルターで濾過後，紫外線照射した水道水をそれぞれ自由摂取させた．
3. 投与量および投与方法
SDラットの雌雄を用いて，被験物質を100，300および1000 mg/kgの用量で14日間経口投与した結果，1000 mg/kg群でも雌雄ともに被験物質による明確な毒性変化は認められなかった．以上の結果から，本試験では高用量を1000 mg/kgとし，以下公比5で中用量を200 mg/kg，低用量を40 mg/kgとした．また，媒体(3％アラビアゴム水溶液)のみを投与する対照群を設けた．
投与期間は，雌雄とも交配前14日間，交配期間，および雄は剖検前日までの計44日間，雌は交尾成立後，妊娠，分娩を経て哺育3日まで(41〜48日間)とし，プラスチック製胃ゾンデを用いて1日1回，午前中に強制経口投与した．投与液量は5 mL/kgとし，至近測定日の体重を基に算出した．
被験物質は3％アラビアゴム水溶液に懸濁させ，投与に供するまで冷蔵保存し，調製後3日以内に使用した．投与開始前に投与液中の被験物質の均一性，安定性および濃度を確認した．
4. 反復投与毒性に関する観察・検査
1) 一般状態
全例について生死，外観，行動等を投与前および投与後に毎日観察した．死亡動物は発見後速やかに剖検した．
2) 体重および摂餌量
体重は，雌雄とも投与開始日，投与開始後3，7，14日，およびその後週1回，交尾した雌は妊娠0，7，14，20日および哺育0，4日に測定した(交尾確認日を妊娠0日，分娩確認日を哺育0日とする)．また，雄では投与開始日の体重を基準に，雌では交配前期間，妊娠期間，哺育期間をそれぞれ投与開始日，妊娠0日，哺育0日の体重を基準に体重増加量を算出した．摂餌量は，交配期間を除き体重測定日に測定した．
3) 雄の血液学検査
雄の全生存動物について，解剖日の前日から約21時間絶食させ，チオペンタールナトリウム(ラボナール:田辺製薬)の腹腔内投与による麻酔下で後大静脈より採取した血液の一部をEDTA-2Kにより凝固阻止し，赤血球数(シースフローDCインピーダンス検出法)，白血球数(RF/DCインピーダンス検出法)，血小板数(シースフローDCインピーダンス検出法)，ヘモグロビン濃度(SLSヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(赤血球パルス波高値検出法)を多項目自動血球分析装置(NE-4500:東亞医用電子)，白血球百分率(Wright染色塗抹標本)を血液細胞自動分析装置(MICROX HEG-70A:オムロン)，網状赤血球数(アルゴンレーザーを用いたフローサイトメトリー法)を自動網赤血球測定装置(R-2000:東亞医用電子)により測定した． また，検査結果から平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)，平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．
4) 雄の血液生化学検査
雄の全生存動物について，解剖日に採取した血液を室温で約30分間静置後遠心分離し，得られた血清についてGOT(SSCC改良法)，GPT(SSCC改良法)，γ-GTP(SSCC改良法)，ALP(GSCC改良法)，総ビリルビン(Jendrassik改良法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaff
法)，グルコース(GK-G6PDH法)，総コレステロール(CES-CO-POD法)，トリグリセライド(LPL-GK-G3PO-POD法)，総蛋白(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白およびアルブミンより算出)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(UV法)，ナトリウム，カリウム，クロール(イオン選択電極法)を自動分析装置(日立736-10形:日立製作所)により測定した．
5) 病理学検査
雌雄とも最終投与日の翌日に，全生存動物についてチオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で腹大動脈の切断・放血により安楽死させて剖検し，胸腺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣および精巣上体の重量を測定した．また，解剖日の体重を基に相対重量(対体重比)を算出した．さらに，これらの器官に加えて，脳，下垂体，眼球およびハーダー腺，甲状腺および上皮小体，心臓，肺，食道，胃，腸管(十二指腸〜直腸)，膀胱，卵巣，子宮，膣，骨髄(大腿骨)，坐骨神経，脊髄および肉眼的異常部位を採取し，10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定後保存した．ただし，死亡例以外の眼球およびハーダー腺はダビドソン液，精巣および精巣上体はブアン液で固定した．
病理組織学検査は雌雄の対照群および1000 mg/kg群の脳，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，胃，十二指腸，副腎，精巣，精巣上体，非妊娠雌の卵巣ならびに全動物の肉眼的異常部位，死亡動物の胸腺，肺について，常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製して鏡検した．
5. 生殖発生毒性に関する観察・検査
1) 生殖機能
交配前の投与期間終了後，各群内で雄1雌1の交配対を設け，最長7日間昼夜同居させ，毎日午前中に雌の膣垢を採取し，ギムザ染色して鏡検した．膣栓形成あるいは膣垢標本中に精子が認められた場合を交尾成立とし，その日を妊娠0日とした．交尾した対は雌雄を分離し，以後の検査に供した．これらの結果から，交尾所要日数(交配開始後，交尾成立までに要した日数)，交尾成立までに逸した発情期の回数，交尾率〔(交尾動物数/同居動物数)×100〕，受胎率〔(受胎動物数/交尾動物数)×100〕を算出した．
2) 分娩・哺育状態
交尾が確認された雌は全例を自然分娩させ，分娩状態を観察した．午前9時の時点で分娩が完了している動物を当該日分娩とし，その日を哺育0日とした．その後，新生児を生後4日(哺育4日)まで哺育させ，授乳，営巣，食殺の有無等の哺育状態を毎日観察した．
母動物は，哺育4日の剖検時に卵巣，子宮を摘出し，黄体数および着床数を検査した．分娩しない雌は交尾確認後26日に剖検し，肉眼的に着床が認められない動物の子宮は10 %硫化アンモニウム水溶液に浸漬して着床の有無を確認した．これらの結果から，妊娠期間(妊娠0日から出産が確認された日までの期間)，出産率〔(生児出産雌数/受胎雌数)×100〕，着床率〔(着床数/黄体数)×100〕，分娩率〔(総出産児数/着床数)×100〕を算出した．
3) 新生児の観察・検査
(1) 新生児の観察
哺育0日に出産児数(出産生児数，死産児数)，性別および外表異常の有無を検査した．その後，一般状態，死亡の有無を哺育4日まで毎日観察した．哺育0および4日の生存児数から出生率〔(出産生児数/総出産児数)×100〕，新生児の4日生存率〔(哺育4日生児数/出産生児数)×100〕を算出した．
(2) 体重
哺育0および4日に全生存児を個体ごとに測定した．また，哺育0日の体重を基準に体重増加量を算出した．
(3) 剖検
哺育4日に全生存児の口腔を含む外表を検査した後，親動物と同様にして安楽死させ，剖検した．死亡動物は食殺等で検査に耐えないものを除き，10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液に浸漬・固定後，実体顕微鏡下で剖検した．
6. 統計解析
計量データについては，パラメトリックデータはBartlett法による等分散性の検定を行い，分散が一様の場合は一元配置分散分析を行った．分散が一様でない場合およびノンパラメトリックデータはKruskal-Wallisの検定を行った．群間に有意な差が認められた場合はDunnett法またはDunnett型の多重比較を行った．計数データのうち，病理組織所見はa×bのχ^2検定を行い，有意差が認められた場合はArmitageのχ^2検定により対照群と各被験物質投与群間の比較を行った．その他の計数データはFisherの直接確率法により検定した．有意水準は5 %とし，新生児に関するデータは各母動物ごとに算出した平均値を標本単位とした．
結果
1. 反復投与毒性
1) 一般状態
1000 mg/kg群の雄1例が投与開始後32日に死亡したが，死亡に関連する一般状態の変化は認められなかった．
軟便が1000 mg/kg群の雄1例，四肢または腹部の脱毛が40，200および1000 mg/kg群の雌雄1〜3例で認められたが，軟便は1回のみの発現であり，脱毛も1000 mg/kg群で多発する傾向はみられなかったことから，偶発的な変化と判断した．なお，対照群の雄1例は投与開始後28日に胃ゾンデの一部を噛み切り，飲み込む事故が発生したため，その時点で試験系から除外した．
2) 体重(Fig.1,2)
雌雄とも全期間を通して体重および体重増加量ともに対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．
3) 摂餌量
雌雄とも全期間を通して対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．
4) 雄の血液学検査(Table 1)
桿状核球比が40および1000 mg/kg群で有意な低値を示したが，生理的変動範囲内の値であり，白血球百分率のその他の項目にも有意な変化は認められなかったことから，偶発的変化と判断した．
5) 雄の血液生化学検査(Table 2)
クレアチニンが40および1000 mg/kg群で有意な低値を示したが，生理的変動範囲内の変化であった．また，無機リンが200 mg/kg群で有意な高値を示したが，1000 mg/kg群では有意な差は認められなかったことから，偶発的変化と判断した．その他の検査項目には有意な変化は認められなかった．
6) 器官重量(Table 3)
雌雄ともにいずれの器官においても，絶対重量および相対重量とも対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．
7) 剖検所見
生存動物では，脾臓の白色斑，食道の結節が40 mg/kg群の雌，精巣または精巣上体の小型化が対照群および200 mg/kg群の雄，腎盂拡張が対照群の雌雄および200 mg/kg群の雄，皮膚の脱毛が40，200および1000 mg/kg群の雌雄で散見されたが，いずれも各群1例のみの発現であったことから，被験物質との関連はないと判断した．
1000 mg/kg群の雄の死亡例では，胸腺の出血，肺，肝臓，腎臓のうっ血が認められた．
8) 組織所見(Table 4)
生存動物では，対照群あるいは被験物質投与群で心臓の限局性の心筋変性／線維化，肝臓の小肉芽腫，壊死巣および限局性の脂肪化，腎臓の好塩基性尿細管，腎盂拡張および間質の限局性炎症性細胞浸潤，精巣の精細管の萎縮および精巣上体の精子の減少が認められた．いずれもラットでしばしば認められる自然発生性の変化であり，1000 mg/kg群で多発する所見もなく，発現頻度にも対照群との間に有意な差は認められなかったことから，被験物質とは関連のない偶発病変と判断した．
肉眼的異常部位の対応する変化として，白色斑の認められた40 mg/kg群の雌1例の脾臓では，壊死巣および炎症性細胞浸潤が認められた．また，皮膚の脱毛部位では，表皮の肥厚が1000 mg/kg群の雄1例に認められたが，他の3例には変化は認められなかった．40 mg/kg群の雌1例で認められた食道の結節は粘膜下の出血巣であり，投与時の物理的刺激によるものと考えられた．なお，非妊娠雌の卵巣には異常は認められなかった．
1000 mg/kg群の雄の死亡例では，胸腺の出血が認められたが，死因につながる変化は認められなかった．
2. 生殖発生毒性
1) 生殖機能(Table 5)
未交尾動物は対照群で1対観察されただけで，他のほとんどの交配対は交配開始後5日以内に雌が発情期を示して交尾し，交尾率，交尾所要日数および交尾成立までに逸した発情期の回数ともに対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．また，非妊娠動物は対照群で1例観察されたのみであり，受胎率にも有意な差は認められなかった．
2) 分娩・哺育状態(Table 6)
非分娩動物が200 mg/kg群で1例認められたが，その他の母動物はいずれも交尾確認後22または23日に正常な分娩を示し，妊娠期間，黄体数，着床数，着床率，出産率および分娩率ともに対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．また，各群いずれの母動物にも哺育行動に異常は認められなかった．なお，非分娩動物では子宮内に着床痕が1個のみ観察された．
3) 新生児に及ぼす影響
(1) 生存率(Table 6)
死産児あるいは生後の死亡児が対照群，40，200および1000 mg/kg群でそれぞれ3，6，5，1例観察されたが，出産児数，出産生児数，性比，出生率および新生児の4日生存率ともに対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．
(2) 外表および一般状態
下顎，腹部および四肢の浮腫が40 mg/kg群の1腹で4例，哺育1〜2日に観察され，いずれも生後3日までに死亡した．その他の動物には外表および一般状態ともに異常は認められなかった．
(3) 体重(Table 6)
各被験物質投与群の雌雄ともに対照群とほぼ同様な体重および体重増加量を示し，有意差は認められなかった．
(4) 剖検
生存動物ではいずれの群にも異常は認められなかった．死亡動物では，腎盂拡張が40 mg/kg群の1腹で1例のみに観察された．
考察
1. 反復投与毒性
反復投与による影響について，一般状態，体重および摂餌量には雌雄ともに被験物質の影響は認められなかった．また，投与終了後の雌雄の剖検，器官重量，病理組織学検査，雄の血液学検査および血液生化学検査においても被験物質に起因する変化は認められなかった．
1000 mg/kg群で雄1例が死亡したが，一般状態，体重をはじめ，病理組織学検査においても死因につながる所見は認められず，原因を特定することはできなかった．しかし，同群では他に死亡は観察されず，他の動物にはいずれの検査においても被験物質による毒性を示す変化は認められなかったことから，被験物質に起因するものではないと判断した．
被験物質は短鎖脂肪酸エステルで，経口投与による毒性は弱いと考えられており２），LD50値は6.4-12.8 g/kgと極めて高い４）．また，飼料中の脂肪をこの脂肪酸エステルに置き換え，その食餌含有量を55％にしても，ラットは良好な状態で成長することが報告されている５）．本試験においても，1000 mg/kg群でも被験物質による毒性を示唆する変化は認められなかった．
2. 生殖発生毒性
親動物の検査において，交尾率，受胎率，黄体数，着床数，着床率，分娩率，出産率，妊娠期間，分娩および哺育行動ともに被験物質の影響を示唆する変化は認められなかった．また，新生児の検査においても，出産児数，出産生児数，性比，出生率，新生児の4日生存率，外表，一般状態，体重および剖検のいずれにも被験物質に起因する変化は認められなかった．したがって，被験物質による親動物の生殖機能，分娩・哺育機能および次世代の発育への影響はないと考えられる．
以上のように，本試験では反復投与による一般毒性学的影響は認められず，また，生殖・発生に及ぼす影響も認められなかった．したがって，本試験条件下における反復投与毒性に関する無影響量は雌雄ともに1000 mg/kg/day，生殖発生毒性に関する無影響量についても，親動物および児動物ともに1000 mg/kg/dayと考えられる．
文献
| 1) | J. W. Bailey, M. W. Haymond, J. M. Miles, J. Parenter. Enteral. Nutr., 15, 32(1991) |
| 2) | 後藤 稠, 池田正之, 原 一郎編，"産業中毒便覧(増補版)," 医歯薬出版, 東京, 1984, pp.889-993. |
| 3) | W. F. Oettingen, Arch. Ind. Health, 21, 28(1960). |
| 4) | D.W. Fassett, "Industrial Hygiene and Toxicology, " 2nd revised edition, Vol. 2, eds. by F. A. Patty, Interscience Publishers, New York, 1963, pp. 1847-1934. |
| 5) | W. M. Cox, J. Biol. Chem., 103, 777(1933). |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 松浦郁夫 |
| 試験担当者： | 青山涼子，土谷 稔，横山光恵，豊田直人，水嶋亜弥子，鈴木美江 |
| 三菱化学安全科学研究所鹿島研究所 |
| 〒314-0255 茨城県鹿島郡波崎町砂山14 |
| Tel 0479-46-2871 | Fax 0479-46-2874 | |
| Correspondence |
| Authors: | Ikuo Matsuura (Study director)
Ryoko Aoyama, Minoru Tsuchitani, Mitsue Yokoyama, Naoto Toyota,
Ayako Mizushima, Yoshie Suzuki |
| Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory |
| 14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255, Japan |
| Tel +81-479-46-2871 | Fax +81-479-46-2874 | |