| AF-2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業 ) |
| 2-AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業) |
| 9-AA | : | 9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.) |
試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．
156〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定(公比2)して行った濃度設定試験では，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において2500 μg/プレート以上の濃度で生育阻害が認められたが，いずれの濃度においても溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．したがって，本試験は，全菌株とも2500 μg/プレートを最高濃度とし，以下公比2で計6濃度を設定して行った．
試験の結果，濃度設定試験と同様，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において2500 μg/プレート濃度で生育阻害が認められ，また，いずれの濃度においても復帰変異コロニー数は，陰性対照値の2倍を越えなかった．
但し，濃度設定試験および本試験ともに代謝活性化法のTA100で若干の濃度依存的な復帰変異コロニー数の増加傾向が認められたため，確認試験を行った．その結果，復帰変異コロニー数の明らかな増加は認められず，濃度依存性傾向も認められなかった．
以上の成績から，本実験条件下では，ジシクロヘキシルアミンは，細菌に対し遺伝子突然変異を誘発しない(陰性)と結論した．
試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その30 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated，Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37℃で12時間振盪培養した．培養後の菌懸濁液は，濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1×10^9 以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．
各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．
提供)は，無色透明の液体で，水に微溶(0.16 g/100 mL)，アルコール，エーテル，ベンゼンおよびアセトンに可溶であり，分子式C12H23N，分子量181.32，純度99.63％(不純物として，ジシクロヘキシルイミン0.119％を含む)の物質である．実験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
)を用い，被験物質を溶解して最高濃度の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定濃度の供試液を調製した．供試液は，用時調製した．
| AF-2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業) |
| 2-AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業) |
| 9-AA | : | 9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.) |
AF-2および2-AAはジメチルスルホキシド(同仁化学研究所)に，SAおよび9-AAは蒸留水(大塚製薬工場)に溶解した．
)を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．
| 硫酸マグネシウム・七水塩 | 0.2 g |
| クエン酸・一水塩 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 寒天(OXOID Agar No.1) | 15 g |
)を購入し，使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．
試験管に使用溶媒0.05 mL，被験物質供試液0.05 mLあるいは陽性対照物質溶液0.1 mLを入れ，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，各濃度とも3枚を使用した．
| 1) | 被験物質処理群において溶媒対照値の2倍以上の復帰変異コロニー数が出現する． |
| 2) | 被験物質濃度の増加とともに復帰変異コロニー数が増加する(濃度依存性)． |
| 3) | 濃度設定試験および本試験の結果から，復帰変異コロニー数の増加に再現性が認められる． |
本試験の結果(Table 3，4)は，濃度設定試験と同様，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株における復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えるものではなかった．また，いずれの菌株においても2500 μg/プレートで生育阻害が認められた．
但し，濃度設定試験および本試験ともに代謝活性化法のTA100において，若干の濃度依存的な復帰変異コロニー数の増加傾向が認められたため，1250〜2500 μg/プレート間でさらに濃度依存性の復帰変異コロニー数の増加が認められるか否かを調べる目的で750〜2500 μg/プレートの範囲で濃度を設定(公差250)し，TA100の代謝活性化法による確認試験を行った．その結果(Table 5)，いずれの濃度においても復帰変異コロニー数の明らかな増加は認められず，濃度依存性傾向も認められなかった．また，1500 μg/プレート以上の濃度では菌の生育阻害が認められた．
以上の成績から，本実験条件下では，ジシクロヘキシルアミンの遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．
ジシクロヘキシルアミンの変異原性については，すでにS. typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537を用いた復帰突然変異試験３）およびシリアンハムスター由来のBHK21cl13細胞を用いたトランスフォーメーション試験４）で陰性と報告されており，一方，ヒトリンパ球を用いた染色体異常試験では陽性５）と報告されている．
| 1) | D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res.，113, 173 (1983). |
| 2) | M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures,"1, Vol.3, eds. by B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
| 3) | K. Mortelmans, S. Haworth, T. Lawlor, W. Speck, B. Tainer, E. Zeiger, Environ. Mutagen., 8(suppl.7), 1(1986). |
| 4) | 賀田恒夫，石館 基 監修，"環境変異原データ集1，" サイエンティスト社，東京，1980, p. 141. |
| 5) | International Agency for Research on Cancer (IARC), "IARC Monographs on Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans,"suppl.6, World Health Organization, Lyon, 1987, pp. 240-241. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 野田 篤 | ||
| 試験担当者： | 野田 篤，昆 尚美 | ||
| (財)畜産生物科学安全研究所 | |||
| 〒229-1132 神奈川県相模原市橋本台3-7-11 | |||
| Tel 042-762-2775 | Fax 042-762-7979 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Atsushi Noda(Study director) Naomi Kon | |||
| Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology | ||||
| 3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132, Japan | ||||
| Tel +81-42-762-2775 | Fax +81-42-762-7979 | |||