4-エチルモルホリンのラットを用いる単回経口投与毒性試験

Single Dose Oral Toxicity Test of 4-Ethylmorpholine in Rats

要約

4-エチルモルホリンのSprague-Dawley系ラットを用いる急性毒性試験を実施した．雌雄各5匹に4-エチルモルホリンの500，1000，1500および2000 mg/kg を単回経口投与し，観察第1日(投与日)から14日間観察を行い，観察第15日に剖検した．

その結果，観察第1日から第2日にかけて，雄では，1500 および2000 mg/kg投与群のそれぞれ1および3例が死亡し，雌では，1000 および2000 mg/kg投与群のそれぞれ1および2例が死亡した． また，一般状態の観察では，1000 mg/kg以上の投与群で，投与直後から間代性ないし強直性痙攣が観察され，その後，すみやかに活動性が低下した．生存例では，一部の動物で観察第2日に排便量の減少が観察されたが，観察第3日には回復した．観察第2日に雌雄ともに1500 mg/kg以上の投与群で，体重減少または増加抑制が認められたが，観察第4日以降は順調に増加した．

剖検時には，死亡例では腺胃粘膜の浮腫ならびに赤色部が観察されたが，生存動物では，肉眼的異常は観察されなかった

以上の結果から，4-エチルモルホリンの LD50値は，雄で1500〜2000 mg/kgの間，雌で2000 mg/kg付近と推定された．

方法

1．被験物質および投与検体の調製法

試験には，日本乳化剤(神奈川)より提供された純度99 %以上の4-エチルモルホリン(ロット番号:2901P0，不純物として水分を0.05 %含む)を用いた．被験物質は，入手後，窒素を充填してから密閉し，冷暗所(冷蔵庫内)に保管した．被験物質の安定性は，試験開始前および試験終了後に提供元において実施された品質試験により確認した．

検体調製では，被験物質を日局注射用水(製造番号:A106AA，光製薬)に溶解して高用量群の投与検体を調製してから，段階希釈して他の投与検体を調製した．投与検体は8日間の安定性が確認されているため，投与前日に調製し，使用時まで冷蔵庫にて保管した．また，含量測定の結果から，各濃度の投与検体中には所定濃度の被験物質が含有されていることを確認した．

2．動物および飼育方法

試験には，4週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD(SD)IGS，SPF)雌雄ラットを日本チャールス・リバー厚木飼育センターから購入し，飼育環境への馴化と検疫を兼ねて入荷日を含む8日間飼育した．群分けは，検疫終了時(投与前日)の測定体重を基に，体重別層化無作為抽出法により行い，雌雄とも1群5匹からなる4群に分けた．投与時の週齢は，雌雄ともに5週齢であった．

動物は，許容温度21.0〜25.0℃，許容湿度40.0〜75.0 %，換気回数約15回/時間，照明12時間(7時〜19時点灯)に制御された飼育室で，金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(CE-2，日本クレア)および水道水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した．

3．投与量の設定および投与方法

投与量は，予備試験の結果に基づいて決定した．すなわち，被験物質の1000，1500および2000 mg/kgを雌雄各2匹のラットに単回経口投与し，1週間の観察を行った結果，1000 mg/kg投与群の雌1例を除く全例で，投与後約5分に間代性ないし強直性痙攣が観察され，投与後約2時間までに2000 mg/kg投与群の雌雄各1例が死亡して，生存全例で活動性の低下が観察された．2000 mg/kg投与群は，投与翌日までに全例が死亡した．また，生存例では，1500 mg/kg投与群の雄1例，雌全例で排便量の減少および体重増加抑制が認められたが，一般状態は観察第3日に回復し，体重は観察第4日以降，順調に増加した．これらの結果から，本試験の高用量には2000 mg/kgを設定し，以下，1500，1000 および500 mg/kgとした．

投与容量は体重1 kg当たり10 mLとし，動物を投与前約18時間絶食させた後，投与直前に測定した体重を基に投与液量を算出し，ラット用胃管を用いて強制的に単回経口投与した．給餌は投与後約3時間に行った．

4．観察および検査

観察第1日(投与日)から14日間にわたって死亡の有無を確認し，各動物の一般状態を観察した．観察は投与日においては投与直後から1時間まで連続して行い，その後は投与後6時間まで約1時間間隔で実施した．観察第2日から15日までは毎日1回行った．

体重は，投与直前，観察第2，4，8，11および15日に測定した．死亡例については死亡発見時に体重を測定し，剖検した．生存例は，観察第15日にペントバルビタール・ナトリウム麻酔下で放血・致死させてから剖検した．

5．データ解析法

体重について，各群の平均値および標準偏差値を雌雄別に算出した．

結果

1000 mg/kg投与群の雌1例，1500 mg/kg投与群の雄1例，2000 mg/kg投与群の雄3例および雌2例が投与後1時間から観察第2日までに死亡した．500 mg/kg投与群では，死亡例は認められなかった(Table 1)．

500 mg/kg投与群では，雌雄とも一般状態に異常は認められなかったが，1000 mg/kg以上の投与群では，1000 mg/kg投与群の雌1例を除く全例で，投与後約5分から間代性ないし強直性痙攣が観察され，その後，腹臥，自発運動減少，振戦，流涎，閉眼および歩行異常が投与後6時間までに観察された．投与翌日には，1500 mg/kg投与群の雄1例および雌2例，2000 mg/kg投与群の雌3例で排便量の減少が観察されたが，投与日にみられた症状はいずれも消失し，観察第3日以降には，異常は認められなかった(Table 2)．

体重推移では，雌雄ともに1500 mg/kg以上の投与群で，観察第2日に体重減少ないし体重増加抑制が認められたが，観察第4日以降はいずれも順調な体重増加を示した．

剖検では，死亡した雄4例，雌3例では，腺胃粘膜の浮腫様肥厚が雄2例，雌3例，腺胃粘膜の赤色部が全例に観察されたが，その他の器官には肉眼的異常は認められなかった．観察15日に剖検した動物には，雌雄とも肉眼的異常は観察されなかった．

考察

死亡動物は，1000 mg/kg投与群で雌1例，1500 mg/kg投与群で雄1例，2000 mg/kg投与群で雄3例および雌2例に認められ，いずれも被験物質投与の影響と考えられた．

一般状態の観察では，投与直後に強直または間代性痙攣が観察され，その後すみやかに活動性が低下したことから，これら神経症状の発現は，被験物質の直接的な作用によるものと考えられた．また，死亡例の剖検の結果，ほぼ全例に腺胃粘膜の浮腫様肥厚および腺胃粘膜の赤色部が観察されたことから，本被験物質は粘膜刺激性を有すると推察された．しかし，1000 mg/kg以上の投与群において，ほぼ全例に重篤な神経症状が発現したものの死亡例は少なく，生存例では投与翌日に排便量の減少が数例観察された以外，異常は認められなかった．また，体重についても，1000 mg/kg以上の投与群で，減少または増加抑制が投与翌日に認められ，被験物質の影響が示唆されたが，観察第4日以降の体重は順調に増加した．

以上の結果より，4-エチルモルホリンの1000〜2000 mg/kgの投与量では，投与直後に重篤な痙攣を誘発するが，死亡率は低く，本試験条件下でのLD50値は，雄で1500〜2000 mg/kgの間，雌で2000 mg/kg付近と推定された．

連絡先
試験責任者：太田　亮
試験担当者：松本浩孝，永田伴子，堀内伸二，
三枝克彦，稲田浩子，安生孝子
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Ryo Ohta(Study director)
Hirotaka Matsumoto, Tomoko Nagata,
Shinji Horiuchi, Katsuhiko Saegusa,
Hiroko Inada, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627