2-ビニルピリジンの細菌を用いる
復帰突然変異試験
Reverse Mutation Test of 2-Vinylpyridine on Bacteria
要約
2-ビニルピリジンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．
検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用い，用量設定試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix無添加群のTA100およびTA1535で39.1〜2500 μg/plateの7用量，同群の他の試験菌株ならびにS9 mix添加群の各試験菌株でそれぞれ156〜5000 μg/plateの6用量で試験を実施した．
その結果，S9 mix添加群のWP2 uvrAで用量に依存した復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められた．2500〜5000 μg/plateの6用量(公差 500)を用いた確認試験を実施した結果，溶媒対照に比較し2.5倍程度の変異コロニー数の増加が示された．
以上の結果より，本試験条件下では2-ビニルピリジンは，変異原性を有する(陽性)と結論した．
方法
1. 試験菌株
細菌を用いる復帰突然変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．
ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB.N.Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所から分与を受けた．平成7年9月5日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK社)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mlずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．
2. 培地の調製
1) 最少グルコース寒天平板培地(プレート)
日清製粉(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02%硫酸マグネシウム・7水塩，0.2%クエン酸・1水塩，1%リン酸二カリウム・無水塩，0.192%リン酸一アンモニウム，0.066%水酸化ナトリウム 〔いずれも最終濃度〕)に2%のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5%の寒天(UNIPATH社:No. 1)を加え，30 mlをシャーレに分注したものである．
2) トップアガー(軟寒天)
Bacto-agar(DIFCO社)0.6%を含む0.5%塩化ナトリウム水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5mM D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．
3. 前培養条件
内容量200 mlの円筒容器(ストレージボトル:Corning Costar社)に2.5%ニュートリエントブロス(UNIPATH社)溶液を25 ml分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μl接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37℃で8時間振盪(往復振盪:120回/分)培養し，試験に使用した．
4. S9 mix
製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
| 成 分 | S9 mix 1 ml中の量 |
| S9 | 0.1 ml |
| MgCl2 | 8 μmol |
| KCl | 33 μmol |
| G-6-P | 5 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| リン酸緩衝Na-液(pH 7.4) | 100 μmol |
| 精製水 | 残 量 |
5. 被験物質
被験物質の2-ビニルピリジン(ロット番号:95-022，CAS No.:100-69-6)は分子式C7H7N，分子量105.15，純度98.3%(不純物として2-ピコリン0.9%，2-エチルピリジン0.4%および2-メチルピリジン0.4%を含む)の液体である．有機合成薬品工業(株)から提供された被験物質を使用した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
6. 被験物質溶液の調製
DMSOに被験物質を溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，直ちに処理を行った(用時調製)．
7. 試験用量の設定
4.88，19.5，78.1，313および1250 μg/プレートの用量を用いて予備的な試験を実施した．その結果，S9 mix無添加群のTA100およびTA1535で1250 μg/プレートにおいて試験菌株に対する生育阻害作用が観察された．また，S9 mix無添加ならびに添加群のWP2 uvrAの1250 μg/プレートにおいて溶媒対照に比較し復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められた．
従って，本試験においてはS9 mix無添加群のTA100およびTA1535で2500 μg/プレート， 同群の他の試験菌株ならびにS9 mix添加群の各試験菌株について5000 μg/プレートを最高用量とし，それぞれ6〜7用量(公比2)を設定した．
また確認試験では，5000 μg/プレートを最高用量とし，6用量(公差500)を設定した．
8. 陽性対照物質
陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20℃)した．
| 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株)) |
| アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株)) |
| 9-アミノアクリジン(ACR:ALDRICH社) |
| 2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株)) |
9. 試験方法
Amesらの原法の改良法であるプレインキュベーション法 1)に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質溶液あるいは陽性対照物質溶液を100 μl，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1M ナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μl，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μlおよび試験菌液100 μlを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，トップアガーを2 ml添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(× 60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．独立して試験を2回実施した．
10. 結果の解析
復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．
なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．
また陽性結果を示した菌株については，当該用量における誘発コロニー数(当該用量のコロニー数−溶媒対照でのコロニー数)を試験用量(mg/プレート)で除すことにより比変異活性(比活性)を算出した．
結果および考察
1回目の試験結果をTable 1〜2に，2回目の試験結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群のいずれも高用量群において，2-ビニルピリジン処理による生育阻害作用が観察された．また，S9 mix添加群のWP2 uvrA株においてのみ用量反応相関性を伴った復帰突然変異コロニー数の増加傾向が観察されたが，2回繰り返して実施した試験において明確に陽性と判定できなかった．再現性を確認するためS9 mix添加群のWP2 uvrA株について確認試験を実施した結果，用量反応相関性を伴った明確な増加傾向が観察され(Table 5)，再現性が確認された．変異原性の強さに関する相対的比較値である比変異活性は10.7を示した．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，試験中析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．以上の試験結果から，本試験条件下において，2-ビニルピリジンの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陽性と判定した．
文献
| 1) | D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976). |
| 連絡先 |
| 試験責任者: | 中嶋 圓 |
| 試験担当者： | 北沢倫世，藤原正孝，板倉真由実 |
| (財)食品農医薬品安全性評価センター |
| 〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2 |
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | |
| Correspondence |
| Authors: | Madoka Nakajima(Study director)
Michiyo Kitazawa，Masataka Fujiwara, Mayumi Itakura |
| Biosafety Research Center，Foods，Drugs and Pesticides(An-pyo Center) |
| 582-2 Shioshinden Aza Arahama,Fukude-cho,Iwata-gun,Shizuoka,437-12,Japan |
| Tel +81-538-58-1266 | Fax +81-538-58-1393 | |