N-メチルアニリンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of N-Methylaniline on Bacteria

要約

　N-メチルアニリンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施した．

　検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA15371) および Escherichia coli WP2 uvrA2)を用い，S9 Mix 無添加および添加試験のいずれも，用量設定試験では，50～5000 μg/プレートの用量で試験を実施したところ，直接法の 5000 μg/プレートでのみ抗菌性が認められたので，本試験では S9 Mix 無添加試験が 156.3～5000 μg/プレート，S9 Mix 添加試験が 312.5～5000 μg/プレートの用量で試験を実施した．

　その結果，2回の本試験とも，用いた5種類の検定菌について，いずれの用量でも溶媒対照群の2倍以上となる変異コロニー数の増加が認められなかったことから，N-メチルアニリンは，用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

　S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日アメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames 博士から分与を受けた．E. coli WP2 uvrA 株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．検定菌は，-80 ℃以下で凍結保存した．各検定菌は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異（rfa）とアンピシリン耐性因子（pKM101）の有無についての特性確認を行った．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2（Oxoid）を入れたL字型試験管に種菌を接種し，37 ℃，10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

N-メチルアニリン（CAS No 100-61-8）は，分子量 107.17 の淡黄色ないし淡褐色透明液体である．純度 99.5%のもの（ロット番号：L-A，不純物として , ジメチルアニリン（0.47%），アニリン（0.014%）および不明（0.016%）を含む，(株)三星化学研究所製造）を(社)日本化学工業協会から供与された．被験物質は，使用時まで室温で密栓して保管した．

　N-メチルアニリンは，ジメチルスルホキシド（以下 DMSO と略，和光純薬工業(株)）に 50 mg/ml になるように調製した後，同溶媒で更に公比2ないし約3で希釈したものを，速やかに試験に用いた．

　N-メチルアニリンの DMSO 溶液中での安定性試験を，本試験での低濃度（1.563 mg/ml）および当研究所で同時に実施した染色体異常試験での高濃度（220 mg/ml）の2濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後4時間における各3サンプルの平均含量は，それぞれ初期値（0時間）の平均に対して，96.3および 99.0%であった．また，本試験Iに用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，1.563 mg/ml溶液の含量は既定濃度に対し，101～103%，50 mg/ml 溶液は，95.7～97.6%であった．以上の結果から，N-メチルアニリンは DMSO 溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．

〔陽性対照物質〕

　用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2：	フリルフラマイド	(上野製薬(株)）
SA：	アジ化ナトリウム	（和光純薬工業(株)）
9AA：	9-アミノアクリジン	(Sigma Chem. Co.）
2AA：	2-アミノアントラセン	(和光純薬工業(株)）

　AF2, 2AA は DMSO（和光純薬工業(株)）に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AA は DMSO に，SA は蒸留水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9 Mix の組成〕

　1）トップアガー（TA菌株用）

　下記の水溶液 (A) および (B) を容量比 10:1 の割合で混合した．

(A)	バクトアガー (Difco)	0.6%
	塩化ナトリウム	0.5%
(B)	* L-ヒスチジン	0.5 mM
	ビオチン	0.5 mM

* ：	WP2 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2）合成培地

　培地は，日清製粉(株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1リットルあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2ｇ
水酸化ナトリウム	0.66ｇ
クエン酸・1水和物	2ｇ
グルコース	20ｇ
リン酸水素二カリウム	10ｇ
リン酸一アンモニウム	1.92ｇ
バクトアガー (Difco)	15ｇ

　径 90 mm のシャーレ1枚あたり 30 ml を流して固めてある．

3） S9 Mix （１ml中下記の成分を含む）

**S9	0.1 ml
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
グルコース-6-リン酸	5 μmol
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液 (pH 7.4)	100 μmol

** ：	7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製した S9 (キッコーマン(株)）を用いた．

〔試験方法〕

　プレート法を用いて，S9 Mix 無添加および添加条件下で試験を行った．

　小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml（S9 Mix 添加試験においては S9 Mix 0.5 ml），検定菌液 0.1 ml およびトップアガー2 mlを混和したのち，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに DMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTable1～2に示した．培養は37 ℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

〔判定基準〕

　用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌の S9 Mix 無添加あるいは添加試験において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する（陽性）と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

　 N-メチルアニリンについて，50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3とし，試験を実施したところ，すべての検定菌において S9 Mix 無添加試験の 5000 μg/プレートの用量で抗菌性が認められた．したがって，本試験における最高用量を，すべての検定菌において，S9Mix 無添加および添加試験では 5000 μg/プレートとし，S9 Mix 無添加試験では6用量，S9Mix 添加試験では5用量を設定することとした．

〔本試験〕

　結果を Table1，2に示した．N-メチルアニリンについて，すべての検定菌について，S9 Mix 無添加試験では 156.3～5000 μg/プレート，S9 Mix 添加試験では 312.5～5000 μg/ プレートの範囲で，公比を2とし，試験を実施した．2回の試験を通して，用いた5種類の検定菌の S9 Mix 添加および無添加試験のいずれにおいても，用量依存性のある変異コロニー数の増加は認められなかった．また，すべての検定菌に対して，5000 μg/プレートにおいて，抗菌性が認められた．以上の結果に基づき，N-メチルアニリンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した．

文献

1)	D.M. Maron, B.N. Ames, Mutation Research, 113, 173-215 (1983).
2)	M.H.L. Green, in "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, (eds.) Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：原　　巧，坂本京子，堀谷尚古, 川上久美子，松木容彦，

（財）食品薬品安全センター秦野研究所

〒257 神奈川県秦野市落合 729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence:

Authors: Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kyoko Sakamoto,
Naoko Horiya, Kumiko Kawakami,
Yasuhiko Matsuki,
Sayaka Iida and Madoka Nakagomi

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan

Tel 81-463-82-4751 Fax 81-463-82-9627

連絡先
	試験責任者：	澁谷　徹
	試験担当者：	原　　巧，坂本京子，堀谷尚古, 川上久美子，松木容彦，
	（財）食品薬品安全センター秦野研究所
	〒257 神奈川県秦野市落合 729-5
	Tel 0463-82-4751	Fax 0463-82-9627

Correspondence:
	Authors:	Tohru Shibuya(Study Director) Takumi Hara, Kyoko Sakamoto, Naoko Horiya, Kumiko Kawakami, Yasuhiko Matsuki, Sayaka Iida and Madoka Nakagomi
	Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
	729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan
	Tel 81-463-82-4751	Fax 81-463-82-9627