3-シアノピリジンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 3-Cyanopyridine on Bacteria

要約

3-シアノピリジンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100，TA1535，TA98，TA1537)およびEscherichia coli (WP2 uvrA)を用い，プレインキュベーション法により実施した．予備試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000～313μg/プレート(公比2)の5濃度を設定した．

2回の本試験の結果とも，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下では3-シアノピリジンは，変異原性を有さない(陰性)と判定された.

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学 B.N. Ames 教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)および東京大学医科学研究所松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．各使用菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後，その20μlをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2，Unipath社)25 gを1 lの精製水に溶解して作成した液体完全培地10 mlに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後，試験に使用した．

〔被験物質〕

3-シアノピリジン(CAS No.:100-54-9，ロット番号:709S4067，純度:99.9%；関東化学(株)製造，(株)パナファーム・ラボラトリーズ提供)は，分子量104.12の水に可溶な白色固体であり通常の取り扱い条件では安定である．なお，本ロットについては試験期間中安定であることを確認した．

3-シアノピリジンは注射用水(DW，ロット番号:K5A81，(株)大塚製薬工場)を用いて最高濃度(50 mg/ml)の溶液を調製した後，同溶媒で公比2で希釈したものを用いた．

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた．

AF-2	:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(純度:98.8%，和光純薬工業(株))
NaN3	:	アジ化ナトリウム(純度:96.5%，和光純薬工業(株))
ENNG	:	N-エチル-N '-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(純度:99.0%，Sigma Chemical Co.)
9-AA	:	9-アミノアクリジン(純度:99%，Sigma Chemical Co.)
2-AA	:	2-アミノアントラセン(純度:98.0%，和光純薬工業(株))

NaN3はDWに，その他はジメチルスルホキシド(関東化学(株))に溶解したものを使用した.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いてD-ビオチン，L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し，これをろ過滅菌後，冷蔵庫に保管した．精製水100 mlに対して，粉末寒天(Bacto-Agar；Difco社)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後，上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム七水塩	0.2 g
クエン酸一水塩	2 g
リン酸水素二カリウム無水塩	10 g
リン酸-アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
ブドウ糖	20 g
寒天(OXOID Agar No. 1)	15 g

径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mlあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．

S9*	0.1 ml
塩化マグネシウム六水塩	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
D-グルコース6-リン酸	5 μmol
b -NADPH	4 μmol
b -NADH	4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol
滅菌精製水	残量

*:	購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄性SD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000 × g 遠心上清分画である．

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した．

試験管に被験物質溶液0.1 mlを分注し，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mlと菌懸濁液0.1 mlを加え，37℃で20分間振盪した．S9 mixを共存させる場合には，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液の代わりに S9 mixを0.5 ml加えた．プレインキュベーション後，トップアガー2 mlを上記の試験管に加えて混和し，最少グルコース寒天平板培地に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養した．実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた後，プレート上の復帰変異コロニー数を自動コロニーカウンターで計測した．予備試験は各濃度あたり1 枚のプレートを使用した．本試験は各濃度あたり3枚のプレートを使用し，再現性を確認するため2回実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

〔試験結果の判定基準〕

いずれかの試験菌株で，S9 mixの有無によらず，被験物質濃度の増加にともなって復帰変異コロニー数(平均値)が陰性対照値の2倍以上に増加し，さらにその増加に再現性が認められる場合に，当該被験物質は陽性と判定した．その他の場合はすべて陰性と判定した．試験結果の判定には統計学的手法は用いなかった．

結果および考察

〔予備試験〕

5000，1250，313，78.1，19.5，4.88，1.22 μg/プレートの濃度で実施した結果，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても抗菌性は認められなかった．従って，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000，2500，1250，625，313 μg/プレートの5濃度を設定した．

〔本試験〕

結果をTable 1,2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施した結果，2回の本試験ともにS9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．また，抗菌性も，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても認められなかった．

以上の結果から，3-シアノピリジンの変異原性は陰性と結論した．

文献

1)	D.M. Maron and B.N. Ames, Mutation Research, 113, 173-215(1983).
2)	M.H.L. Green and W.J. Muriel, Mutation Research, 38, 3-32(1976).

連絡先

試験責任者：水野文夫

試験担当者：榎本佳明，石毛裕子

(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所

314-02 茨城県鹿島郡波崎町砂山14

Tel 0479-46-2871 Fax 0479-46-2874

Correspondence

Authors: Fumio Mizuno(Study director)
Yoshiaki Enomoto, Yuko Ishige

Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory

14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan

Tel +81-479-46-2871 Fax +81-479-46-2874

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	試験責任者：	水野文夫
	試験担当者：	榎本佳明，石毛裕子
	(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
	314-02 茨城県鹿島郡波崎町砂山14
	Tel 0479-46-2871	Fax 0479-46-2874

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	Authors:	Fumio Mizuno(Study director) Yoshiaki Enomoto, Yuko Ishige
	Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
	14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan
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