3-シアノピリジンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 3-Cyanopyridine on Bacteria

要約

3-シアノピリジンについて,細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した.

検定菌として,Salmonella typhimurium(TA100,TA1535,TA98,TA1537)およびEscherichia coli (WP2 uvrA)を用い,プレインキュベーション法により実施した.予備試験の結果をもとに,本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000〜313μg/プレート(公比2)の5濃度を設定した.

2回の本試験の結果とも,S9 mixの有無によらず,いずれの菌株においても陰性対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果より,本試験条件下では3-シアノピリジンは,変異原性を有さない(陰性)と判定された.

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学 B.N. Ames 教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98,TA100,TA1535,TA1537 1)および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた.各使用菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存した.

試験に際して,各凍結菌株を融解後,その20μlをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2,Unipath社)25 gを1 lの精製水に溶解して作成した液体完全培地10 mlに接種し,37℃で8時間振盪培養した.培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後,試験に使用した.

〔被験物質〕

3-シアノピリジン(CAS No.:100-54-9,ロット番号:709S4067,純度:99.9%;関東化学(株)製造,(株)パナファーム・ラボラトリーズ提供)は,分子量104.12の水に可溶な白色固体であり通常の取り扱い条件では安定である.なお,本ロットについては試験期間中安定であることを確認した.

3-シアノピリジンは注射用水(DW,ロット番号:K5A81,(株)大塚製薬工場)を用いて最高濃度(50 mg/ml)の溶液を調製した後,同溶媒で公比2で希釈したものを用いた.

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた.
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(純度:98.8%,和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(純度:96.5%,和光純薬工業(株))
ENNG:N-エチル-N '-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(純度:99.0%,Sigma Chemical Co.)
9-AA:9-アミノアクリジン(純度:99%,Sigma Chemical Co.)
2-AA:2-アミノアントラセン(純度:98.0%,和光純薬工業(株))
NaN3はDWに,その他はジメチルスルホキシド(関東化学(株))に溶解したものを使用した.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1) トップアガー

アミノ酸水溶液として,精製水を用いてD-ビオチン,L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し,これをろ過滅菌後,冷蔵庫に保管した.精製水100 mlに対して,粉末寒天(Bacto-Agar;Difco社)0.6 g,塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え,オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後,上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し,約45℃に保温した.

2) 最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し,使用した.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム七水塩0.2 g
クエン酸一水塩2 g
リン酸水素二カリウム無水塩10 g
リン酸-アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
ブドウ糖20 g
寒天(OXOID Agar No. 1)15 g
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

S9 mix 1 mlあたり以下の組成で調製し,使用時まで氷中に保存した.
S9*0.1 ml
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
b -NADPH4 μmol
b -NADH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
滅菌精製水残量
*:購入したS9(キッコーマン(株))を使用した.このS9は,7週齢の雄性SD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000 × g 遠心上清分画である.

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した.

試験管に被験物質溶液0.1 mlを分注し,0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mlと菌懸濁液0.1 mlを加え,37℃で20分間振盪した.S9 mixを共存させる場合には,0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液の代わりに S9 mixを0.5 ml加えた.プレインキュベーション後,トップアガー2 mlを上記の試験管に加えて混和し,最少グルコース寒天平板培地に重層した.重層したトップアガーが凝固した後,37℃で48時間培養した.実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し,被験物質による抗菌性の有無を調べた後,プレート上の復帰変異コロニー数を自動コロニーカウンターで計測した.予備試験は各濃度あたり1 枚のプレートを使用した.本試験は各濃度あたり3枚のプレートを使用し,再現性を確認するため2回実施した.また,被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて,被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた.

〔試験結果の判定基準〕

いずれかの試験菌株で,S9 mixの有無によらず,被験物質濃度の増加にともなって復帰変異コロニー数(平均値)が陰性対照値の2倍以上に増加し,さらにその増加に再現性が認められる場合に,当該被験物質は陽性と判定した.その他の場合はすべて陰性と判定した.試験結果の判定には統計学的手法は用いなかった.

結果および考察

〔予備試験〕

5000,1250,313,78.1,19.5,4.88,1.22 μg/プレートの濃度で実施した結果,S9 mixの有無によらず,いずれの菌株においても抗菌性は認められなかった.従って,本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000,2500,1250,625,313 μg/プレートの5濃度を設定した.

〔本試験〕

結果をTable 1,2に示した.上記の濃度範囲で試験を実施した結果,2回の本試験ともにS9 mixの有無によらず,いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった.また,抗菌性も,S9 mixの有無によらず,いずれの菌株においても認められなかった.

以上の結果から,3-シアノピリジンの変異原性は陰性と結論した.

文献

1)D.M. Maron and B.N. Ames, Mutation Research, 113, 173-215(1983).
2)M.H.L. Green and W.J. Muriel, Mutation Research, 38, 3-32(1976).

連絡先
試験責任者:水野文夫
試験担当者:榎本佳明,石毛裕子
(株)三菱化学安全科学研究所 鹿島研究所
314-02 茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Fumio Mizuno(Study director)
Yoshiaki Enomoto, Yuko Ishige
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874