4-ヒドロキシ安息香酸の
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
4-Hydroxybenzoic acid on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

4-ヒドロキシ安息香酸の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)および短時間処理(6時間)における 50% 細胞増殖抑制濃度は，連続処理(24時間)　および短時間処理(6時間)ともに 1.2 mg/ml であった．各系列での処理濃度は，連続処理および短時間処理で 1.4 mg/ml(10 mM)を最高処理濃度とし，公比2で4濃度設定した．なお，48時間連続処理の濃度は，24時間連続処理と同じ濃度に設定した．連続処理では，S9 mix 非存在下で24時間および48時間連続処理後，短時間処理では S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，すべての処理方法で 0.70 mg/ml の濃度であったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU 細胞を24時間連続処理した高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)が誘発され，その頻度は 30.5% であった．一方，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．48時間連続処理した高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)および倍数性細胞が誘発され，その誘発頻度は 19.5% および 12.62% であった．短時間処理では，S9 mix 非存在下において，いずれの処理群でも染色体の構造異常および倍数性細胞は誘発されなかった．S9 mix 存在下では，高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)が誘発された(28.2%)．また，低濃度群(0.18 mg/ml)および高濃度群(0.70 mg/ml)では，倍数性細胞が有意に誘発され，その誘発頻度は 1.13% および 1.18% であった．しかしながら，傾向性検定の結果，濃度依存性は認められなかった．

4-ヒドロキシ安息香酸を培養液に添加すると，培養液が黄色化することから，本物質の染色体異常誘発作用に関しては，培養液の酸性化による可能性と，物質自身の DNA 傷害作用による2つの可能性が考えられた．このため，染色体の構造異常と倍数性細胞が有意に誘発された48時間連続処理群について，被験物質溶液の pH を調整し，in vitro 小核試験および染色体異常試験による確認試験を実施したところ，小核および染色体異常の誘発は認められなかった．従って，4-ヒドロキシ安息香酸処理によって誘発された染色体異常は，それ自身の DNA への傷害作用よりも，培養液の酸性化によって，二次的に生じることが示唆された．

方法

1．使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来の CHL/IU 細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2．培養液の調製

培養には，牛胎児血清(FCS:Cansera International)を 10% 添加したイーグル MEM(日水製薬(株))培養液を用いた．

3．培養条件

2 × 10^4 個の CHL/IU 細胞を，培養液 5 ml を入れたディッシュ(径 6 cm，Corning)に播き，37℃の CO2インキュベーター(5% CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目に S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4．被験物質

4-ヒドロキシ安息香酸(略号:HBA，CAS No.:99-96-7，ロット番号:GI0681，上野製薬 (株))は，白色結晶性粉末で，水に対しては 0.8 g/100 g，DMSO では 2M 以上，アセトンでは 50 mg/ml 以上，メタノールでは 3.3 g/100 g で溶解し，融点214-217℃で，分子式 C7H6O3，分子量138.13，純度 99.7 %(不純物としてサリチル酸 0.02 wt%，4-ヒドロキシイソフタル酸 0.03 wt% を含む)の物質である．

被験物質原体は，常温，常圧では水，熱には安定である．

5．被験物質の調製

被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒は DMSO(和光純薬工業 (株))を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 0.5%(v/v)になるように加えた．なお濃度の記載について，純度換算は行わなかった．

6．細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL/IU 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業 (株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，すべての処理群において 50% の増殖抑制濃度は，1.2 mg/ml であった(Fig．1)．

7．実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理，短時間処理ともに 1.4 mg/ml(10 mM)とし，公比2で4濃度を設定した(0.18，0.35，0.70，1.4 mg/ml)．なお，連続処理の48時間処理群の濃度は，24時間処理群と同じ濃度に設定した．一方，追加試験として実施した48時間処理の小核試験では，上記の染色体異常試験と同様に4濃度(0.18，0.35，0.70，1.4 mg/ml)設定し，染色体異常試験では3濃度(0.35，0.70，1.4 mg/ml)設定した．陽性対照物質として用いたマイトマイシン C(MC，協和醗酵工業 (株))およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，注射用水((株) 大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験においては1濃度あたり4枚ディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．

8．染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1 mg/ml になるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を 3% ギムザ溶液で染色した．

9．染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20% 以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに 0.5% 以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，連続処理，短時間処理ともに 0.7 mg/ml が染色体分析の可能な最高濃度であったことから，これらの濃度を含む3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験(MMS)研究会1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10．記録と判定

細胞を剥離し，遠心して得られた細胞に 3 ml の 0.15 M KCl を加えてピペッティングし，約20分間低張処理をした．その後，メタノール・酢酸(5:1)の固定液を細胞懸濁液に加え細胞を固定した．遠心して固定液を捨て，再び固定液を 10 ml 加えてピペッティングし遠心した．固定液を捨て，少量の固定液を加えて細胞を懸濁後，スライド上に一滴滴下して風乾した．染色は，水で調整した 40 μg/ml のアクリジンオレンジ溶液をスライド上に数滴落とし，カバーグラスを掛けた．

11．小核の観察および小核の判定基準

観察は，蛍光顕微鏡を用いて行い，細胞質を含み細胞質周辺の明瞭な間期細胞1000個/群について観察し，小核を持った細胞を算定した．小核の判定は通常の基準2)に従った．

12．記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒の背景データと被験物質処理群間でフィッシャーの直接確率法3)(多重性を考慮して familywise の有意水準を 5% とした)により，有意差検定を実施した．また，フィッシャーの直接確率法で有意差が認められた場合には，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定4) (p<0.05)を行った．小核試験では，溶媒対照群と被験物質処理群間でフィッシャーの直接確率法(p<0.05)により，有意差検定を行った．最終的な判定は，統計学的および生物学的な評価に基づいて行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果を Table 1 に示した．4-ヒドロキシ安息香酸を加えて24時間連続処理した高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)が誘発され，その頻度は 30.5% であった．一方，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．48時間連続処理した高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)および倍数性細胞が誘発され，その誘発頻度は 19.5% および 12.62% であった．

短時間処理による染色体分析の結果を Table 2 に示した．4-ヒドロキシ安息香酸を加えてS9 mix 非存在下における短時間処理では，いずれの処理群でも染色体の構造異常および倍数性細胞は誘発されなかった．S9 mix 存在下では，高濃度群(0.70 mg/ml)において，染色体の構造異常(gap を含む)が誘発され，その頻度は 28.2% であった．また，低濃度群(0.18 mg/ml)および高濃度群(0.70 mg/ml)では，倍数性細胞が有意に誘発され，その誘発頻度は 1.13% および 1.18% であった．しかしながら，傾向性検定の結果，濃度依存性は認められなかった．

4-ヒドロキシ安息香酸を培養液に添加すると，培養液が黄色化することから，本物質の染色体異常に関しては，培養液の酸性化による可能性と，物質自身のDNA 傷害作用による2つの可能性が考えられた．このため，染色体の構造異常と倍数性染色体が有意に誘発された48時間連続処理群について，被験物質溶液を pH 調整後，in vitro 小核試験および染色体異常試験を追加試験として実施した．その結果，Table 3 に示すように最高濃度(1.4 mg/ml:10 mM)においてのみ小核(Type 2)の有意な増加が認められたが，出現頻度は 1.9% と低く，またType 2 以外の異常の増加は認められなかった．一方，染色体異常試験の追加試験(Table 4)においても，染色体の有意な増加は認められなかった．これらの結果より，4-ヒドロキシ安息香酸処理によって観察された染色体異常は，それ自身の DNA 傷害作用に基づくものではなく，培養液の酸性化によって生じた二次的な作用によることが示唆された．

文献

1) 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988．
2) 日本組織培養学会編，培養細胞小核試験 "細胞トキシコロジー試験法"，朝倉書店，東京，1991
3) 吉村　功　編著'" 毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ'" サイエンティスト社，東京，1987．
4) 吉村　功，大橋靖夫　編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析'" 地人書館，東京，1992，pp.218-223．

連絡先：
試験責任者田中憲穂
試験担当者 山影康次，若栗　忍，日下部博一，
水谷正寛，澁谷　徹，渡辺千津子，
橋本恵子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Kohji Yamakage，Shinobu Wakuri,
Hirokazu Kusakabe' Masahiro Mizutani,
Tohru Shibuya，Chizuko Watanabe,
Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute，Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai，Hadano-shi，Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751FAX +81-463-82-9627