雄では体重および摂餌量に4-メチル安息香酸の投与の影響は認められなかった．最終剖検では，1000 mg/kg投与群において精巣上体の重量および相対重量に低下が認められたが，精巣重量には4-メチル安息香酸投与による影響は認められなかった．雌の体重増加については，着床率の低下や哺育児数の減少といった4-メチル安息香酸の生殖毒性に起因すると考えられる抑制が300 mg/kg以上の投与群の妊娠末期および哺育期間中に認められた．摂餌量については1000 mg/kg投与群において投与初期および妊娠14〜15日に軽度な増加が認められた．また哺育期間中には哺育児数の減少による生理的変化に起因すると考えられる軽度な低下が認められた．剖検時の肉眼観察においても4-メチル安息香酸の投与に起因した異常は観察されなかった．
交配については，交尾率，交尾までの平均発情回帰回数および平均同居日数ならびにその間に雌が回帰した発情の回数に4-メチル安息香酸投与の影響は認められなかった．しかし，4-メチル安息香酸の投与により受胎率は有意に低下し，1000 mg/kg投与群における受胎率は約70 %となった．また，300 mg/kg以上の投与群において着床率が低下し，産児数が減少した．さらに，1000 mg/kg投与群では産児数の減少に伴い，出産生児数ならびに哺育4日における生児数が減少した．
いずれの投与群も正常な妊娠期間を経て分娩し，分娩状態および哺育状態に投与の影響は認められなかった．また，出生時ならびに出生後における児の生存能の指標である生児出産率，出生率および新生児生存率にも投与の影響は認められなかった．さらに，哺育0および4日における性比ならびにこの時期における雌雄の体重にも投与の影響は認められず，また，4-メチル安息香酸の投与に起因した出生児の形態異常も観察されなかった．
以上の結果から，300 mg/kg以上の4-メチル安息香酸は着床前の胚死亡を増加させ，1000 mg/kgの4-メチル安息香酸は雄性生殖毒性を示し，また着床後胚死亡の軽度な増加を疑わせたが，雌の性周期，排卵，分娩および哺育，ならびに出生児の生存および発育に4-メチル安息香酸の投与は影響を及ぼさず，また形態異常も誘発しないものと結論された．しかし，着床前胚死亡の増加が雌雄いずれに対する4-メチル安息香酸の影響によるものであるかについては，本試験からは明らかにならなかった．
投与検体の調製に際しては，各濃度毎に被験物質を秤量し，乳鉢で磨砕後，媒体(0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液)を加え，ミキサー(あわとり練太郎，シンキー)で攪拌した．さらに，これに媒体を加えて，いずれの用量においても投与液量が5 mL/kg体重になるように各濃度の投与検体を調製した．投与検体の調製に用いた媒体はカルメロースナトリウム(丸石製薬)を注射用水(光製薬)に溶解して調製した．投与検体は，冷蔵条件下における8日間の安定性が確認されていたので，1週間に1回以上の頻度で調製し，冷蔵条件下で保管して調製後7日以内に使用した．投与検体中に含まれる被験物質の含量および均一性は，秦野研究所において確認した．
各動物は，許容温湿度各21.0〜25.0℃，および40.0〜75.0 %，換気回数約15回/時間，照明12時間(7〜19時点灯)にそれぞれ制御された飼育室で，金属製金網床ケージに個別に収容し，固型飼料(CE-2，日本クレア)および飲料水(水道水，秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した．妊娠18日(腟栓あるいは精子発見日=妊娠0日)以後の母動物は，ラット用プラスチック製繁殖ケージに収容し，哺育4日(分娩日哺育=0日)まで紙パルプ製チップ(ペパークリーン，日本エスエルシー)を床敷として供給して飼育した．
各用量の投与検体は，雄に対しては交配前2週間から最長2週間の交配期間を経て剖検前日に至るまでの連続42日間，また，雌に対しては交配前2週間，交尾までの交配期間，妊娠期間および哺育3日まで，交尾したが分娩しない雌は妊娠25日相当日まで，交尾しなかった雌には投与52日までそれぞれ毎日1回，9時〜13時の間に，調製検体をマグネティックスターラーで絶えず攪拌しながら採取し，ラット用胃管を用いて経口投与した．各動物の投与液量は，雌雄とも最近時の体重をもとに，個体別に算出した．
分娩を確認した全例について妊娠期間(妊娠0日〜分娩日の日数)を算定し，出産率〔(生児出産雌数/受胎動物数)×100，%〕を各群について求めた．また，哺育1日から毎日，哺育状態を観察し，哺育4日の剖検において数えられた着床数および妊娠黄体数から着床率〔(着床数/妊娠黄体数)×100，%〕を算出した．
出生児は，哺育0日に，雌雄別に産児数(生存児+死亡児)を調べ，分娩率〔(産児数/着床痕数)×100，%〕，生児出産率〔(出産生児数/着床痕数)×100，%〕および出生率〔(出産生児数/産児数)×100，%〕を算出した．生存児については外表奇形の有無を観察した．翌日(哺育1日)から哺育4日まで毎日一般状態を観察し，生児数と死亡児数を雌雄別に数えて新生児の4日の生存率〔(哺育4日の生児数/哺育0日の生児数)×100，%〕を算出した．生存児については，哺育0および4日に個別の体重を測定し，各腹ごとに雌雄別の平均値を算出するとともに哺育0および4日における性比〔(哺育0あるいは4日雄生児数/哺育0あるいは4日生児数)×100，%〕を算出した．
採取した器官および組織のうち，精巣ならびに精巣上体はブアン液(長期保存は0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液を使用)に固定し，その他は0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に固定して保存した．
一般状態については，1000 mg/kg投与群において，雄では投与29〜35日の週から剖検前日まで，雌では投与25〜32日に，投与後一過性の流涎が少数例に認められた．また，雌の対照群および1000 mg/kg投与群の各1例において，投与30〜41日および投与37日から剖検日までに脱毛が認められた．その他の動物には一般状態の異常は認められなかった．
雌では，100 mg/kg投与群の体重はいずれの時期においても対照群と同様に推移し，体重増加量および累積体重増加量にも対照群との間で有意差は認められなかった．300 mg/kg以上の投与群では，交配前の投与期間中は，体重，体重増加量および累積体重増加量のいずれにも対照群との間に有意差は認められなかったが，妊娠期間中は，妊娠14〜20日の体重増加量が対照群と比べて有意(p<0.01，p<0.05)に低い値を示した．この時期の体重および妊娠期間中におけるこの時期までの累積体重増加量については対照群との間に有意差は認められなかった．哺育期間中は，300 mg/kg以上の投与群において，分娩日である哺育0日の体重が対照群と比べて有意(p<0.05)に高い値を示し，1000 mg/kg投与群において哺育0〜4日の体重増加量が対照群と比較して有意(p<0.01)に低い値を示した．300 mg/kg投与群における哺育0〜4日の体重増加量には対照群との間に有意差は認められなかった．
雌では，300 mg/kg以下の投与群では，いずれの時期においても被験物質投与の影響は認められなかった．1000 mg/kg投与群では投与1〜2日および妊娠14〜15日の値が対照群と比較して有意(p<0.05)に増加した．また，哺育3〜4日の値は対照群と比較して有意(p<0.01)に低い値を示した．
雌では，対照群および100 mg/kg投与群の動物に異常は認められなかった．300 mg/kg投与群では，交尾しなかった1例および交尾したが不妊であった1例の子宮が拡張し，管腔内に白濁液の貯留が認められた．また，これらの動物のうち，不妊であった例の両側卵巣は小さかった．これらの他に，病変部として，300 mg/kg投与群では，哺育4日に剖検した1例に脾臓および腸間膜リンパ節の腫大が認められた．また，1000 mg/kg投与群では，哺育4日に剖検した1例の胸部皮膚に脱毛が認められた．
精巣上体については，対照群では精細管の萎縮が認められた例において，両側の管腔内に細胞残屑のごく軽度な増加が認められた．300 mg/kg投与群において剖検時に精巣上体尾部に黄白色結節が認められた例には，結節部に精子肉芽腫が認められた．1000 mg/kg投与群では，対照群には認められなかった精子の少ない管腔が全例の両側精巣上体尾部に観察され，対照群と比較して頻度および程度ともに有意差(p<0.01)が認められた．これらのうち，交尾した雌が不妊であった2例を含む5例には細胞残屑のごく軽度な増加も認められた．100 mg/kg投与群に異常は認められなかった．
雌において，剖検時に卵巣の小型化が認められた300 mg/kg投与群の1例を含めて，300 mg/kg以下の投与群の卵巣に異常は認められなかった．1000 mg/kg投与群では，不妊であった1例の両側卵巣に閉鎖卵胞が顕著に認められたが，頻度および程度ともに対照群との間に有意差は認められなかった．
子宮については，剖検時に拡張および白濁液の貯留が認められた300 mg/kg投与群の2例に，管腔の拡張ならびに子宮内膜の上皮および間質に好中球の浸潤が認められ，それらのうち，不妊であった方の内膜間質には浮腫も認められた．その他の投与群の子宮には，異常は認められなかった．
腟については，300 mg/kg投与群の子宮に異常が認められた2例の上皮に好中球の浸潤が認められ，それらのうち，不妊であった例の上皮は分泌期を示していた他に，対照群を含むいずれの投与群にも異常は認められなかった．
剖検時に病変部として採取された300 mg/kg投与群の1例の脾臓および腸間膜リンパ節は，いずれにも壊死巣の散在ならびに好中球およびマクロファージの浸潤が観察された．しかし，脱毛の認められた1000 mg/kg投与群の胸部皮膚に異常は認められなかった．
1000 mg/kg投与群の1例は，哺育2日に出生児の全例(2匹)が死亡したが，この例を含めていずれの投与群の動物にも哺育状態の不良は認められなかった．
生存能については，100 mg/kg以下の投与群に被験物質投与の影響は認められなかったが，産児数は300 mg/kg以上の投与群において，また，出産生児数は1000 mg/kg投与群において，それぞれ対照群と比較して有意な低値を示し，そのために哺育4日における生児数も有意(p<0.05)な低値を示した．しかし，分娩率，生児出産率，出生率，新生児の4日の生存率については対照群との間に有意差は認められなかった．また，哺育0日および哺育4日における性比にも対照群と被験物質各投与群との間で有意差は認められなかった．
体重についても，雌雄ともにいずれの時期も対照群と被験物質各投与群との間で有意差は認められなかった．
生存産児の形態観察では，1000 mg/kg投与群の1腹において雄の1例にチアノーゼが観察されたが，翌日には回復し，その後はチアノーゼを認める例はなかった．その他の投与群の生存産児には形態異常は認められなかった．また，死亡児の剖検では，いずれの投与群においても形態異常は認められなかった．哺育4日の剖検では，1000 mg/kg投与群の1腹において雄の1例に，腎盂拡張が観察されたが，その他の動物に異常は認められなかった．
雄では，流涎の他に一般状態の異常は認められず，体重増加および摂餌量にも4-メチル安息香酸の投与による影響は認められなかった．しかし，1000 mg/kg投与群において精巣上体重量が有意に低下したことから，4-メチル安息香酸の雄動物に対する一般毒性学的無作用量は300 mg/kgであると考えられる．
雌では，300 mg/kg以上の投与群において体重増加の抑制が認められた．しかし，その時期は妊娠14〜20日であり，分娩日すなわち哺育0日における体重はむしろ高値を示していた．ラットにおいて妊娠14〜20日の時期は胎児の発育期に当たり，この時期における母動物の体重増加は，胎児の数および発育に負うところが大きい．300 mg/kg以上の投与群では，着床率および産児数が低下していたことから，この時期にみられた体重増加抑制は，母動物に対する4-メチル安息香酸の一般毒性学的な影響ではなく，生存胎児数の減少による二次的変化であると考えられる．1000 mg/kg投与群における哺育0〜4日の体重増加抑制も，産児数が少なかったために，分娩による体重減少が少なくなり，そのために哺育期間中の回復幅が小さくなったためであると考えられる．
雌における摂餌量については，1000 mg/kg投与群において投与1〜2日および妊娠14〜15日の値が軽度に増加し，哺育0〜4日の値が減少した．反復経口投与毒性試験2)においても雌において摂餌量の増加が認められていたことから，投与1〜2日および妊娠14〜15日における摂餌量の増加は4-メチル安息香酸投与による影響であると考えられる．一方，哺育期間中における摂餌量の減少は，4-メチル安息香酸投与による直接作用よりもむしろ，哺育児数が少なかったため，泌乳に必要とされる栄養要求量が低かったことによる生理的変化であると考えられる．剖検では，300 mg/kg投与群において脾臓および腸間膜リンパ節の腫大が認められ，病理組織学検査において壊死巣の散在ならびに好中球およびマクロファージの浸潤が観察された．これらの変化は1例にのみ認められたものであり，1000 mg/kg投与群に関連した変化が認められなかったことから，4-メチル安息香酸の投与による影響ではないと考えられる．これらのことから，雌における4-メチル安息香酸の一般毒性学的無作用量は，流涎および体重増加の認められなかった300 mg/kgであると考えられる．
本試験と同じ用量の4-メチル安息香酸を，本試験に用いたのと同系統のラットに28日間反復投与しても，精巣上体に重量変化や病理学的変化は認められていない2)．本試験と反復投与毒性試験2)との間では，投与期間および投与開始時週齢が異なる．本試験において認められた変化が，投与期間の相違によって生じたものか，投与開始時における性成熟の程度の違いによって生じたものであるのかは，本試験結果からは明らかにならなかった．
4-メチル安息香酸の投与を受けた雄の生殖器に認められたその他の変化として，精細管の萎縮(100 mg/kg投与群)，精巣上体尾部の精子肉芽腫(300 mg/kg投与群)ならびに精細管の多核巨細胞(1000 mg/kg投与群)があるが，いずれも1例のみの変化であり，対照群にも同程度に認められた変化であることから，4-メチル安息香酸の投与による変化ではないと考えられる．
雌については，性周期に投与の影響は認められなかった．また，黄体数にも投与の影響は認められなかったことから，1000 mg/kgまででの4-メチル安息香酸は排卵に影響を及ぼさないものと考えられる．
交尾能力については，300 mg/kg投与群の1組を除いて全例が交尾し，交尾率，交尾までの同居期間ならびに同居期間中に雌が回帰した発情の回数にも投与の影響は認められなかったことから，1000 mg/kgまででの4-メチル安息香酸は影響を及ぼさないものと考えられる．交尾の認められなかった300 mg/kg投与群の1組については，交配期間中に雌が性周期の回帰を停止したことにより交尾しなかったものと考えられる．本例の剖検では，子宮管腔が拡張して内部に白濁液が貯留しているのが認められ，病理組織学検査では子宮内膜の上皮あるいは間質に好中球の浸潤が認められたことから，子宮蓄膿であったと判断された．子宮蓄膿は，300 mg/kg投与群において不妊であった1例にも認められているが，1000 mg/kg投与群には，妊・不妊にかかわらず認められていないことから，自然発生によるものと考えられる．
受胎能力については，被験物質投与群における受胎率が対照群と比較して有意に低下した．対照群および100 mg/kg投与群では交尾した全例が受胎した一方で，1000 mg/kg投与群では受胎率が約70 %に低下したことから，1000 mg/kgの4-メチル安息香酸は受胎に影響を及ぼすものと考えられる．300 mg/kg投与群においても不妊が1例に認められたが．本例は，前述のように子宮蓄膿であったことから，4-メチル安息香酸の投与による不妊である可能性は乏しい．
4-メチル安息香酸の受胎に及ぼす影響が，雄に認められた精巣上体の病理学的変化に起因するものであるか，受精から着床までの間における胚死亡の増加によるものであるのかは明らかではない．しかし，精巣上体に異常の認められなかった300 mg/kg投与群においても着床率が有意に低下したこと，1000 mg/kg投与群では交尾確認時に採取した腟スメアに精子が確認された例の中にも不妊が認められたことから，受胎率の低下は胚の着床前死亡による可能性が高い．また，4-メチル安息香酸に類似した構造を有するm-nitrobenzoic acid(CAS No.:121-92-6)のCD-1マウスを用いた混餌投与による連続交配試験3)においても同腹生児数の低下が報告されている．同報告3)では，雌の生殖が雄のそれに比してm-nitrobenzoic acidに対して高い感受性を有していると結論されているが，本試験では認められなかった性周期の異常あるいは妊娠期間の延長も認められている．また，優性致死作用など雄に対する影響によっても，着床率が低下することから，本試験において認められた受胎率および着床率の低下が，雌雄いずれに対する4-メチル安息香酸の影響によって生じた変化であるのかは，さらに検討を要するものと考えられる．
300 mg/kg以上の投与群では産児数が減少した．300 mg/kg投与群の各動物における分娩率(75.0〜100 %)は，対照群および100 mg/kg投与群の各動物における分娩率の範囲内(71.4〜100 %)に入っていたことから，着床率の低下に起因した変化であると推測される．1000 mg/kg投与群については，対照群との間に有意差は認められなかったが，9例中2例がこれらの群における分娩率の範囲を下回っていたことから，着床後における胚死亡の軽度な増加が疑われた．
分娩に対して4-メチル安息香酸投与の影響は認められなかった．哺育については，1000 mg/kg投与群において1腹の全出生児が哺育2日に死亡した．本例は，産児数が2と著しく少なかった例であり，分娩状態および哺育状態に異常は認められなかった．また，本例以外に新生児の4日の生存率が低かった例は認められなかったことから，偶発的変化であると考えられ，4-メチル安息香酸の投与は哺育に影響を及ぼさないと考えられる．
雌の病理組織学検査では，300 mg/kg投与群において子宮蓄膿が認められた既述の例に，子宮内膜間質の浮腫，腟上皮の好中球浸潤が認められたが，いずれも子宮蓄膿に随伴した変化であると考えられる．また，300 mg/kg投与群における腟上皮粘膜の分泌期像および1000 mg/kg投与群の卵巣における顕著な閉鎖卵胞はいずれも1例にのみ認められた変化であることから，4-メチル安息香酸の投与による影響である可能性は乏しいと考えられる．
出生児の生存能については，1000 mg/kg投与群において出産生児数および哺育4日の生児数の減少が認められたが，出生率および新生児の4日の生存率には投与の影響が認められなかったことから，産児数の減少に起因した変化であると考えられる．性比および発育についても4-メチル安息香酸の投与による影響は認められなかった．形態異常については，1000 mg/kg投与群の生存産児の観察において1例の雄にチアノーゼが認められた．また，哺育4日の剖検では，チアノーゼが認められたのと同じ腹の雄の1例に腎盂拡張が観察された．これらの変化は1腹のみに認められたものであり，哺育1日以降の一般状態に異常も観察されなかった．また，腎盂の拡張は本試験に使用した系統のラットではしばしば認められる変化であることから，4-メチル安息香酸の投与による影響である可能性は乏しい．従って，1000 mg/kgまでの4-メチル安息香酸は出生児の形態に影響を及ぼさないものと考えられる
| 1) | 化学物質データベース．Kis-NET，番号1139，国立環境研究所(2003). |
| 2) | 関 剛幸ら：4-メチル安息香酸のラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験．化学物質毒性試験報告，11：204-215(2004)． |
| 3) | m-Nitrobenzoic acid: in “Reproductive Toxicology”, Environ Health Perspect, 105: Supple 325-326(1997). |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 代田眞理子 | ||
| 試験担当者： | 田子和美 | ||
| （財）食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Mariko Shirota(Study director) Kazumi Tago | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257-8523, Japan | ||||
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | |||