p-tert-ブチルフェノールの細菌を
用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of p-tert-Butylphenol on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として,p-tert-ブチルフェノールについて,細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し,陰性の結果を得た.

検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により,用量設定試験を50.0〜5000 μg/ プレートの用量で行ったところ,S9 mix無添加およびS9 mix 添加において,すべての検定菌において抗菌性が認められた.

したがって,本試験では S9 mix無添加試験を15.6〜500 μg/プレート(WP2 uvrA は31.3〜1000 μg/プレート),S9 mix添加試験を15.6〜500 μg/プレート(TA98, およびWP2 uvrAは31.3〜1000 μg/プレート)の範囲で用量を設定し,試験を実施した.

その結果, S9 mix無添加試験ではすべての検定菌において,500 μg/プレート,S9 mix添加試験では 500 μg/プレート(TA98およびWP2 uvrAは1000 μg/プレート)の用量で抗菌性が認められた.復帰変異コロニー数は,2回の本試験とも,用いた検定菌について,いずれの用量においても増加は認められなかったことから,p-tert-ブチルフェノールは,用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた.

E. coli WP2 uvrA株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.

検定菌は− 80℃以下で凍結保存したものを用い,ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

〔被験物質〕

p-tert-ブチルフェノール(CAS No. 98-54-4)は,分子量 150.22 の白色フレークである.試験には,大日本インキ化学工業(株)製〔ロット番号: C514,純度 99.9%(不純物:2,6-ditert-ブチルフェノール16 ppm,2,4-ditert-ブチルフェノール103 ppm,o-tert-ブチルフェノール2 ppm,フェノール18 ppm)〕のものを,(社)日本化学工業協会から供与され,使用時まで室温で保管し,用いた.

p-tert-ブチルフェノールは,ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解性がよいことからDMSOに10 mg/mlまたは50 mg/mlになるように溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.

試験の開始に先立って, p-tert-ブチルフェノールの DMSO 溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,低濃度(156 μg/ml)溶液は本試験気把汗修靴燭發里砲弔い董い泙森眷仕(16.0 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて,室温遮光条件下で,実施した.その結果,調製4時間後における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間) の平均値に対して,97.6および101%であった.また,含量測定試験を行った結果,低濃度(156 μg/ml)は96.0%,高濃度(10.0 mg/ml)は98.0%であった.

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.
AF2 :2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA :アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA :9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA :2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))

AF2, 2AA は DMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを−20℃で凍結保存し,用時解凍した.9AA は DMSO に,SA は純水に溶解し,速やかに試験に用いた.

〔培地および S9 mix の組成〕

1) トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー (Difco) 0.6%
塩化ナトリウム0.5%
(B) *L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5 mM

* :WP2 uvrA 用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物 0.2g
クエン酸・1水和物2g
リン酸水素二カリウム10g
リン酸一アンモニウム1.92g
水酸化ナトリウム0.66g
グルコース20g
バクトアガー (Difco)15g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり 30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

1 ml中下記の成分を含む
S9**0.1 ml
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコース-6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液 (pH 7.4) 100 μmol
** :7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9 を用いた.

〔試験方法〕

プレート法により, S9 mix 無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った.

小試験管中にトップアガー 2 ml,被験物質調製液 0.1 ml,リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix 添加試験においては S9 mix 0.5 ml),検定菌液 0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりに DMSO ,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.

用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌の S9 mix 無添加あるいはS9 mix添加条件において,被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が,溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し,かつ,その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした.

結果および考察

〔用量設定試験〕

50.0〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として,試験を実施したところ,S9 mix 無添加試験ではWP2 uvrA が1500 μg/プレート以上で,その他は500 μg/プレート以上で抗菌性が認められた.また,S9 mix添加試験ではTA98とWP2 uvrA が1500 μg/プレート以上で,その他は500 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められた.

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table1,2 に示した.p-tert-ブチルフェノールの用量を,S9 mix無添加試験では15.6 〜500 μg/プレート(WP2 uvrA は31.3〜1000 μg/プレート),S9 mix添加試験では15.6 〜500 μg/プレート(TA98と WP2 uvrA は31.3〜1000 μg/プレート)の範囲で公比を2として設定し試験を実施した.本試験気TA1537において,S9 mix無添加条件の125 μg/プレートの用量のみ変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上となったが,その増加に用量依存性が認められず,再現性もなかったことから陰性と判定した.その他の検定菌では2回の試験のいずれも,S9 mix無添加試験および添加試験において,溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果に基づき, p-tert-ブチルフェノールは,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:坂本京子,川上久美子,原  巧,堀谷尚古,松木容彦,中込まどか,飯田さやか
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257 秦野市落合729-5
Tel. 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya (Study Director)
Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami, Takumi Hara, Naoko Horiya, Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi, and Sayaka Iida
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan
Tel. +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627