2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test
of 2-(4-Morpholinyldithio)benzothiazole in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

細胞増殖抑制試験結果をもとに，短時間処理法-S9処理では108 μg/mLを最高処理濃度とした5.04〜108 μg/mLの濃度範囲で7用量を，+S9処理では300 μg/mLを最高処理濃度とした23.3〜300 μg/mLの濃度範囲で6用量を設定した．S9 mix存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．-S9処理では14.0, 23.3, 38.9 μg/mL，+S9処理では38.9, 64.8, 108 μg/mLのそれぞれ3用量(公比1.25)について顕微鏡観察を実施した．

その結果，-S9処理および+S9処理のいずれにおいても用量相関性を伴い，統計学的に有意な染色体異常の誘発が認められたが，強い細胞毒性作用が認められた用量であることと，出現頻度が低いことから確認試験を実施した．

確認試験では，短時間処理法-S9処理で70.0 μg/mLを最高処理濃度とした20.0〜70.0 μg/mLの濃度範囲で6用量を，+S9処理では130 μg/mLを最高処理濃度とした80.0〜130 μg/mLの濃度範囲で6用量を設定し，-S9処理では20.0, 30.0, 40.0 μg/mLの3用量，+S9処理では80.0, 90.0, 100, 110, 120 μg/mLの5用量(公差10 μg/mL)について顕微鏡観察を実施した．

その結果，-S9処理および+S9処理のいずれにおいても用量相関性を伴い，統計学的に有意な染色体異常の誘発が認められた．しかしながら，-S9処理群でみられた陽性反応は全て極めて高い細胞毒性を示す濃度での反応であり，相対細胞増殖率14.8 %で陰性を示すため，明確な陽性反応ではないことから疑陽性と判断した．一方，+S9処理群では30〜50 %の相対細胞増殖率で陽性であることから陽性反応と判断した．

以上の結果より，本試験条件下では2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールは，染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1．試験細胞株

哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験に広く使用されていることから，試験細胞株としてチャイニーズ・ハムスターの肺由来の線維芽細胞株(CHL/IU)を選択した．昭和59年11月15日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受け，ジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を10 vol%添加した後，液体窒素中に保存した．試験に際しては凍結細胞を融解し3〜5日ごとに継代したものを使用した．なお，細胞増殖抑制試験では継代数7，染色体異常試験では同8，染色体異常試験(確認試験)では同16の細胞を用いた．

2．培養液の調製

Eagle-MEM液体培地(旭テクノグラス)に，非働化(56℃，30分)済み仔牛血清(Invitrogen)を最終濃度で10 vol%になるよう加えた後，試験に使用した．調製後の培養液は冷暗所(4℃)に保存した．

3．培養条件

CO2インキュベーター(三洋電機メディカシステム)を用い，CO2濃度5 %，37℃の条件で細胞を培養した．

4．S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製した．また，S9 mixの組成は松岡らの方法 1)に従った．S9 mixの組成を以下に示す．
成分S9 mix 1 mL中の量
S90.3 mL
MgCl25 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADP4 μmol
HEPES緩衝液(pH 7.2)4 μmol
蒸留水0.1 mL

5．被験物質

被験物質の2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール(ロット番号:202001)は純度98.4 %の淡黄白色の固体である．本剤は水，アセトンに難溶であるが，DMSO中での分散性が良好であり，かつ同溶液中で安定である．大内新興化学(東京)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで冷蔵庫で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6．被験物質液の調製

試験の都度，モレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSOに被験物質を均一に懸濁させ，調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7．細胞増殖抑制試験(予備試験)

被験物質の細胞毒性および細胞分裂に及ぼす影響に関する情報を得るため，あらかじめ，2844 μg/mL(10 mM相当)を最高用量とし853, 256, 76.8, 23.0 μg/mL(公比10/3)の用量での試験を実施した．その結果，短時間処理法+S9処理の2844 μg/mLおよび連続処理法24時間処理の23.0 μg/mLにおいて細胞が死滅していた．従って，細胞増殖抑制試験では，-S9処理で500 μg/mLを，+S9処理で2000 μg/mLを最高用量とし，以下それぞれ公比2で減じた10用量を設定した．

12ウエルの細胞培養用マルチプレートに細胞を播種し，培養3日後に被験物質液を処理した．S9 mix非存在下(-S9処理)あるいは存在下(+S9処理)で6時間処理した後，新鮮な培養液に交換してさらに18時間培養を続けた．

細胞を10 vol%中性緩衝ホルマリン液(和光純薬工業)で固定した後，0.1 w/v%クリスタル・バイオレット(関東化学)水溶液で10分間染色した．色素溶出液(30 vol%エタノール，1 vol%酢酸水溶液)を適量加え，5分間程度放置して色素を溶出した後，分光光度計(105-50型:日立製作所)を用いて580 nmでの吸光度を測定した．各用量群について溶媒対照群での吸光度に対する比，すなわち相対細胞増殖率を算出し，さらにプロビット法を用いて50 %細胞増殖抑制濃度を算出した．

その結果，細胞増殖を50 %抑制する濃度は，短時間処理法-S9処理で11.2 μg/mLおよび+S9処理で57.4 μg/mLと算出された(Fig. 1)．

なお，被験物質処理開始時，-S9処理の125 μg/mL以上の用量で白色粉末状の，500 μg/mLの用量で白色膜状の析出物が認められ，+S9処理の250 μg/mL以上の用量で白色粉末状の，2000 μg/mLの用量で白色膜状の析出物が認められた．処理終了時，-S9処理の125 μg/mL以上の用量で白色粉末状の，500 μg/mLの用量で白色膜状の析出物が認められ，+S9処理の250 μg/mL以上の用量で白色粉末状の，500 μg/mL以上の用量で白色塊状の析出物が認められた．なお，本被験物質調製液は，125 μg/mL以上の用量で均一な懸濁状態であったため，処理開始および処理終了時の培養液中に懸濁物の残存が認められた．

8．試験用量および試験群の設定

細胞増殖抑制試験結果をもとに，染色体異常試験では短時間処理法-S9処理で108 μg/mLを，+S9処理で300 μg/mLを最高処理濃度とし，以下それぞれ公比5/3で減じた7または6用量ならびに溶媒対照群を設定した．

さらに，染色体異常試験結果より，両試験系において確認試験を実施し，-S9処理では70.0 μg/mLを，+S9処理では130 μg/mLを最高処理濃度とし，以下それぞれ公差10 μg/mLで減じた7用量を設定した．

なお，陽性対照として，-S9処理でマイトマイシンC(MMC:協和醗酵工業)を0.1 μg/mL，+S9処理でシクロホスファミド(CP:塩野義製薬)を12.5 μg/mLの用量で試験した．

9．染色体標本の作製

直径60 mmのプレートを用い，細胞増殖抑制試験と同様に被験物質等の処理を行った．培養終了2時間前に，最終濃度で0.2 μg/mLとなるようコルセミド(Invitrogen)を添加した．トリプシン処理で細胞を剥離させ，遠心分離により細胞を回収した．75 mmol/L塩化カリウム水溶液で低張処理を行った後，固定液(メタノール3容:酢酸1容)で細胞を固定した．空気乾燥法で染色体標本を作製した後，1.2 vol%ギムザ染色液で12分間染色した．

10．染色体の観察

各プレートあたり100個，すなわち用量当たり200個の分裂中期像を顕微鏡下で観察し，染色体の形態的変化としてギャップ(gap)，染色分体切断(ctb)，染色体切断(csb)，染色分体交換(cte)，染色体交換(cse)およびその他(oth)の構造異常に分類した．同時に，倍数性細胞の出現率を記録した．染色体の分析は日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会による分類法2)に従って実施した．

すべての標本をコード化した後，染色体分析を実施した．

11．結果の解析

ギャップを含めない場合(-gap)について染色体構造異常の出現頻度を表示した．

各試験群の構造異常を有する細胞あるいは倍数性細胞の出現頻度を，Fisherの直接確率計算法(有意水準0.05)を用いて検定した．また用量依存性については，Cochran Armitageの傾向検定(有意水準0.05)を用いて検定した．溶媒対照群と比較し被験物質処理群において有意差が認められ，かつ，再現性あるいは用量に依存性が認められた場合に陽性と判定した．

また，分裂中期像の20 %にいずれかの異常を誘発するのに必要な被験物質濃度であるD20値を最小二乗法により算出し，一定濃度(mg/mL)あたりの交換型異常(cte)出現数を示す比較値であるTR値を，染色分体交換の出現頻度(%)を被験物質濃度(mg/mL換算)で割ることにより算出した．

12．細胞増殖抑制度の測定

染色体標本作製時に各プレートの低張処理した細胞液を一定量採取し，ATP測定用試薬キット(ルシフェール250:キッコーマン)およびATPフォトメーター(ルミテスター C-100LU:キッコーマン)を用いて相対発光量(Relative Light Unit:RLU)を測定した．陰性対照群におけるRLUに対する比(=相対細胞増殖率)を各用量群について求め，細胞増殖抑制度とした．

結果および考察

短時間処理法での試験結果をTable 1〜2に示した．2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール処理群の場合，染色体構造異常出現頻度は，-S9処理では14.0 μg/mLで2.0 %，23.3 μg/mLで3.0 %(p≦0.05)，38.9 μg/mLで6.5 %(p≦0.05)を示し，+S9処理では38.9 μg/mLで0.0 %，64.8 μg/mLで0.5 %，108 μg/mLで5.5 %(p≦0.05)を示した．倍数性細胞の出現頻度は，-S9処理では溶媒対照と比較し僅かに高値を示し，+S9処理では試験用量に依存した有意(p≦0.05)な増加が認められ，108 μg/mLにおいては3.0 %を示したが，そこでの相対細胞増殖率が9.0 %と極めて高い細胞毒性を示したので生物学的に有意な増加でないと判断した．なお，その倍数性細胞の約半数は核内倍加であった．また，試験用量に依存した相対細胞増殖率の減少が観察され，-S9処理では染色体異常評価群中の高用量である38.9 μg/mLでの相対細胞増殖率が5.5 %であった．+S9処理では染色体異常評価群中の高用量である108 μg/mLでの相対細胞増殖率は9.0 %であった．一方，S9 mix非存在下における陽性対照物質MMCで処理した細胞，およびS9 mix存在下における陽性対照物質CPで処理した細胞では染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．なお，被験物質処理開始および処理終了時，-S9処理の108 μg/mLの用量で白色粉末状の析出物が認められ，+S9処理の180 μg/mL以上の用量で白色粉末状の析出物が認められた．なお，本被験物質調製液は，180 μg/mL以上の用量で懸濁状態であったため，処理開始および処理終了時の培養液中に懸濁物の残存が認められた．

以上の通り，-S9処理および+S9処理のいずれにおいても，試験用量に依存した有意(p≦0.05)な染色体構造異常の誘発が認められたが，強い細胞毒性作用が認められた用量であること，また出現頻度が低いことから確認試験を実施した．確認試験の結果をTable3〜4に示した．2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール処理群での染色体構造異常出現頻度は，-S9処理では20.0 μg/mLで2.0 %，30.0 μg/mLで2.5 %，40.0 μg/mLで6.5 %(p≦0.05)を示し，試験用量に依存した有意な増加(p≦0.05)が認められたが，極めて高い細胞毒性を示す濃度での反応であった．+S9処理では80.0 μg/mLで4.0 %(p≦0.05)，90.0 μg/mLで8.5 %(p≦0.05)，100 μg/mLで5.0 %(p≦0.05)，110 μg/mLで7.0 %(p≦0.05)，120 μg/mLで9.0 %(p≦0.05)を示した．倍数性細胞の出現頻度は，-S9処理では溶媒対照と比較し僅かに高値を示し，+S9処理では試験用量に依存した有意(p≦0.05)な増加が認められ，110 μg/mLにおいては3.0 %を示したが，そこでの相対細胞増殖率が21.8 %と高い細胞毒性を示していたことから生物学的に有意な増加でないと判断した．なお，その倍数性細胞の約半数は核内倍加であった．また，試験用量に依存した相対細胞増殖率の減少が観察され，-S9処理では染色体異常評価群中の高用量である40.0 μg/mLでの相対細胞増殖率が8.7 %であった．+S9処理では染色体異常評価群中の高用量である120 μg/mLでの相対細胞増殖率は8.8 %であった．一方，S9 mix非存在下における陽性対照物質MMCで処理した細胞，およびS9 mix存在下における陽性対照物質CPで処理した細胞では染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．なお，被験物質処理開始時，-S9処理の60.0 μg/mL以上の用量で白色粉末状の析出物が認められ，+S9処理の70.0 μg/mL以上の用量で白色粉末状の析出物が認められた．処理終了時，-S9処理の70.0 μg/mLの用量で白色粉末状の析出物が認められ，+S9処理の70.0 μg/mL以上の用量で白色粉末状の析出物が認められた．

変異原性の強さに関する相対的比較値であるD20値の最小値は0.306(mg/mL)，TR値の最大値は66.7(mg当たり)と算出された．

以上の試験結果から，本試験条件下において2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールのチャイニーズ・ハムスター培養細胞に対する染色体異常誘発性に関し，陽性と判定した．

なお，本被験物質[2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール]について，Ames試験で陰性との報告3)があった．類縁体であるbenzothiazolについてもAmes試験で陰性との報告3)があった．さらに，類縁体であるmorpholineについてもAmes試験および染色体異常試験で陰性結果4, 5)であったが，長期毒性試験で経口投与されたラットの肝臓と肺に腫瘍が少し認められたとの報告5)があった．

文献

1)Matsuoka A, Hayashi M, Ishidate M Jr: Chromosomal aberration tests on 29 chemicals combined with S9 mix in vitro. Mutation Res, 66:277-290(1979)．
2)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(編):「化学物質による染色体異常アトラス」朝倉書店，東京(1988)pp. 31-35．
3)HPV Chemical Challenge Program: Benzothiazole-based thiazoles Category, American Chemistry Council. Available from URL: http://www.epa.gov/chemrtk/bnzthict/c13324tc.htm, November, 2001.
4)労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課(監修):労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，日本化学物質安全・情報センター，東京(1996)p.68.
5)Morpholine. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum, 47:199-213(1989)．

連絡先
試験責任者：益森勝志
試験担当者：赤星まゆみ，永井美穂，
菊池正憲，仲村渠奈美子，
尾伸也，梶原玲子，
嶋田佐和子，鈴木雅也
（財）食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Shoji Masumori(Study director)
Mayumi Akahoshi, Miho Nagai,
Masanori Kikuchi,
Namiko Nakandakari,
Shin-ya Ozaki, Reiko Kajihara,
Sawako Shimada, Masaya Suzuki
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393