N-フェニルマレイミドのラットを用いる単回経口投与毒性試験

Single Dose Oral Toxicity Test of N-Phenylmaleimide in Rats

要約

N-フェニルマレイミドを雌雄ラットに1回経口投与し，その毒性について検討した．投与量は，500 mg/kgを最高用量とし，以下250，125および62.5 mg/kgとした．対照として媒体(コーンオイル)投与群を設けた．各群の使用動物数は雌雄各5例とした．

死亡は，125 mg/kg群で雄2例，250 mg/kg群で雄4例と雌5例，500 mg/kg群で雌雄各5例認められた．一般状態の観察において，雌雄とも125 mg/kg以上の群で腹臥，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化などがみられた．体重は，各投与群の雌雄において低値あるいは低値傾向がみられた．剖検では，生存例において雌雄とも前胃粘膜肥厚がみられた．死亡例において，雌雄とも腺胃粘膜暗赤色化あるいは赤色化，前胃粘膜水疱などがみられた．

N-フェニルマレイミドのLD50値は，雄が153 mg/kg(95 %信頼限界:100〜237 mg/kg)，雌が188 mg/kgであった．

方法

1.　被験物質および媒体

被験物質のN-フェニルマレイミドは，黄色フレーク状の物質である[Lot No.N-00919，純度:99.2 %，大八化学工業(株)(大阪)]．入手後は，室温・遮光・気密条件下で保管した．

被験物質は，コーンオイルで懸濁して調製した．なお，0.5および50 mg/mLの調製液は，室温・遮光条件下で7日間保存しても安定性に問題のないことを確認している．投与に使用した各投与検体中の被験物質濃度を測定した結果，被験物質濃度に問題はなかった．

2.　使用動物および飼育条件

4週齢のSprague-Dawley系雌雄ラット[SPF, Crj:CD(SD)IGS]を日本チャールス・リバー(株)から購入した．入手した動物は，5日間の検疫期間およびその後2日間の馴化期間を設け，一般状態および体重推移に異常の認められなかった動物を群分けした．群分けは，コンピュータを用いて体重を層別に分けた後に，無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように投与日に行った．

動物は，室温20〜26 ℃，湿度40〜70 %，明暗各12時間(照明:午前6時〜午後6時)，換気回数12回/時に維持されている飼育室で飼育した．検疫・馴化期間中および群分け前の絶食時間中はステンレス製ケージを用いて1ケージ当たり5匹までの雌雄別群飼育とし，群分け後はステンレス製ケージを用いて個別飼育した．飼料は，固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))を自由に摂取させた．ただし，投与前日の夕刻から投与までの約20時間と投与後約6時間まで絶食させた．飲料水は，水道水を自由に摂取させた．ただし，群分け時から投与後約6時間までは絶水させた．

3.　投与経路，投与方法および投与量

投与経路は，経口投与を選択した．投与に際しては，金属製経口胃ゾンデを取り付けたポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を用いて，強制経口投与した．投与液量は，投与直前に測定した体重を基準として10 mL/kgで算出した．投与回数は1回とした．投与日の週齢は5週齢であり，体重範囲は雄が98〜113 g，雌が90〜99 gであった．

N-フェニルマレイミドのラット経口投与時のLD50値は188 mg/kgとの報告がある1)．そこで，当試験では，500 mg/kgを最高用量とし，以下公比2により250，125および62.5 mg/kg群を設定した．また，対照として媒体(コーンオイル)のみを同容量投与する群を設けた．1群の動物数は，雌雄それぞれ5例とした．

4.　観察および検査項目

1)　観察期間

投与後14日間とした．

2)　一般状態

投与日は投与前および投与後6時間(投与後30分まで，投与後2，4および6時間)まで，投与翌日からの観察期間中は1日1回，一般状態および死亡の有無を観察した．

3)　体重測定

投与日および投与後1，3，7，10ならびに14日に測定した．

4)　剖検

死亡動物は，速やかに剖検した．

生存動物は，観察期間終了時にエーテル麻酔下で腹大動脈から放血致死させた後に剖検した．

5.　統計解析

LD50値は，Probit法あるいはBehrns-Karber法で算出した．

体重は，Bartlett法による等分散性の検定を行い，等分散の場合には一元配置法による分散分析を行い，有意ならばDunnett法により行った．一方，等分散と認められなかった場合は，順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallisの検定)を行い，有意ならば順位を利用したDunnett型の検定法により行った．

結果

1.　死亡状況および一般状態(Table 1)

対照群および62.5 mg/kg群の雌雄ならびに125 mg/kg群の雌では，死亡例は認められなかった．死亡は，125 mg/kg群で雄2例，250 mg/kg群で雄4例と雌5例，500 mg/kg群で雌雄各5例認められた．

一般状態の観察において，対照群では下痢が雌雄でみられた．62.5 mg/kg群では，雌雄とも異常はみられなかった．

125 mg/kg群では，死亡例の雄において下痢，腹臥，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化がみられ，投与後1日に2例が死亡した．生存例の雄では，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化がみられたが，投与後1日以降は異常は認められなかった．生存例の雌では，下痢，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化がみられたが，投与後1日以降は異常は認められなかった．

250 mg/kg群では，死亡例の雄において下痢，耳介および四肢の蒼白化，自発運動の低下，腹臥および呼吸緩徐がみられ，投与後1日に4例が死亡した．死亡例の雌では，下痢，耳介および四肢の蒼白化，自発運動の低下，腹臥がみられ，投与後4時間に1例と投与後1日に4例が死亡した．生存例の雄では，耳介および四肢の蒼白化，自発運動の低下，腹臥および被毛の汚れがみられたが，投与後3日以降に異常は認められなかった．

500 mg/kg群では，死亡例の雄において腹臥，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化，被毛の汚れ，横臥，呼吸緩徐および流涙がみられ，投与後2，4および6時間に各1例と投与後1日に2例が死亡した．死亡例の雌において，流涎，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化，腹臥，呼吸緩徐および流涙がみられ，投与後6時間に3例と投与後1日に2例が死亡した．

2.　体重推移

62.5 mg/kg群では，雄において投与後1日に体重の低値傾向がみられたが，その後は順調に推移した．雌では，投与後3日に体重の低値傾向がみられたが，その後は順調に推移した．

125 mg/kg群では，対照群と比べて投与後1日に体重の有意な低値がみられたが，その後は順調に推移した．雌では，対照群と比べて投与後3日に体重の有意な低値がみられたが，その後は順調に推移した．

250 mg/kg群では，投与後1日に体重の減少がみられたが，その後は順調に推移した．

3.　生存例の剖検

前胃粘膜肥厚が，62.5 mg/kg群の雌雄，125 mg/kg群の雌雄および250 mg/kg群の雄でみられた．

4.　死亡例の剖検

125 mg/kg群では，腺胃粘膜暗赤色化，腺胃粘膜潰瘍および前胃粘膜水疱が雄でみられた．250 mg/kg群では，腺胃粘膜暗赤色化および前胃粘膜水疱が雌雄でみられた．500 mg/kg群では，腺胃粘膜赤色化，腺胃粘膜暗赤色化，前胃粘膜赤色化および前胃粘膜水疱が雌雄，小腸および大腸赤色化が雌でみられた．

考察

N-フェニルマレイミドの雌雄ラットへの1回経口投与により，雄では125 mg/kg以上の投与，雌では250 mg/kg以上の投与で死亡例が認められ，一般状態では雌雄とも125 mg/kg以上の投与で腹臥，自発運動の低下，耳介および四肢の蒼白化などがみられ，雌雄とも62.5 mg/kg以上の投与で体重の増加抑制，生存例および死亡例の剖検で胃に変化が認められた．N-フェニルマレイミドのLD50値は，雄が153 mg/kg(95 %信頼限界:100〜237 mg/kg)，雌が188 mg/kgであった．

文献

1)大八化学工業(株)，未発表．

連絡先
試験責任者：古橋忠和
試験担当者：三輪芳久，牧野浩平，内藤一嘉，吉島賢一
(株)日本バイオリサーチセンター　羽島研究所
〒501-6251　岐阜県羽島市福寿町間島6-104
Tel 058-392-6222　Fax 058-392-1284

Correspondence
Authors:Tadakazu Furuhashi (Study director) Yosihisa Miwa, Kohei Makino, Kazuyoshi Naito, Ken-ichi Yoshijima
Nihon Bioresearch Inc.
6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan
Tel +81-58-392-6222　Fax +81-58-392-1284