2-ヒドロキシベンズアルデヒドの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2-Hydroxybenzaldehyde on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として,2-ヒドロキシベンズアルデヒドについて,細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し,陰性の結果を得た.

検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により,用量設定試験を50〜5000 μg/プレートの用量で行ったところ,すべての検定菌において,S9 mix無添加試験およびS9 mix添加試験で抗菌性が認められた.したがって,本試験はS9 mix無添加試験を31.3〜1000 μg/プレート(TA100は15.6〜500 μg/プレート,WP2 uvrAは125〜4000 μg/プレート),S9 mix添加試験を 62.5 〜2000 μg/プレート(TA100は15.6〜500 μg/プレート,WP2 uvrAは125〜4000 μg/プレート)の範囲で用量を設定し,試験を実施した.

その結果,抗菌性は, S9 mix無添加試験では,500 μg/プレート(TA100 およびTA1537),1000 μg/プレート(TA98およびTA1535)および4000 μg/プレート(WP2)で,S9 mix添加試験では,500 μg/プレート(TA100),2000 μg/プレート(TA1535,TA98およびTA1537)および4000 μg/プレート(WP2)で認められた.復帰変異コロニー数は,2回の本試験とも,用いたすべての検定菌で,いずれの用量においても増加は認められなかったことから,2-ヒドロキシベンズアルデヒドは,用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた.

E. coli WP2 uvrA株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.

検定菌は− 80℃以下で凍結保存したものを用い,ニュートリエントブロスNo.2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

〔被験物質〕

2-ヒドロキシベンズアルデヒド(CAS No. 90-02-8)は,分子量 122.12 の淡黄色液体である.試験には,セイミケミカル(株)製[ロット番号:082316,純度 95%以上(不純物:不明)]のものを,(社)日本化学工業協会から供与されたもの,使用時までガラス製容器に入れ,窒素ガスで空気と置換密栓して室温で遮光保管し用いた.

2-ヒドロキシベンズアルデヒドは,ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解性がよいことから,DMSOに20〜50 mg/mlの範囲で溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.

試験の開始に先立って, 2-ヒドロキシベンズアルデヒドのDMSO溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,低濃度(156 μg/ml)溶液は本試験兇把汗修靴燭發里砲弔い董い泙森眷仕(40.0 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて,室温遮光条件下で,安定性を調べた.その結果,調製4時間後における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して,99.6および98.4%であった.また,本試験兇把汗修靴身鏝格質調製液について含量測定試験を行った結果,調製後の濃度はそれぞれ低濃度は102%,高濃度は101%であった.

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.

AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2, 2AAはDMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを−20℃で凍結保存し,用時解凍した.9AAはDMSOに,SAは純水に溶解し,速やかに試験に用いた.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1) トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー(Difco)0.6%
塩化ナトリウム0.5%
(B)* L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5 mM

*:WP2 uvrA用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
バクトアガー(Difco)15 g
径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

1 ml中下記の成分を含む
S9**0.1 ml
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコースー6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウムーリン 酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol

**:7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた.

〔試験方法〕

プレート法により, S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った.

小試験管中にトップアガー 2ml,被験物質調製液0.1 ml,リン酸緩衝液0.5 ml(S9 mix添加試験においては S9 mix 0.5 ml),検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.

用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った.

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において,被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が,溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し,かつ,その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした.

結果および考察

〔用量設定試験〕

50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として,試験を実施したところ,S9 mix無添加試験ではWP2 uvrA 5000 μg/プレートで,TA100が500 μg/プレート以上で,その他は1500 μg/プレート以上で抗菌性が認められた.また,S9 mix添加試験ではTA100が500 μg/プレート以上で,その他は 1500 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められた.

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1,2に示した.2-ヒドロキシベンズアルデヒドの用量を,S9 mix無添加試験は31.3〜1000 μg/プレート(TA100は15.6〜500 μg/プレート,WP2 uvrAは125〜4000 μg/プレート),S9 mix添加試験は62.5〜2000 μg/プレート(TA100およびWP2 uvrAはS9 mix 添加試験と同一用量)の範囲で公比を2として設定し試験を実施した.その結果,2回の試験のいずれも,用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において,溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果に基づき, 2-ヒドロキシベンズアルデヒドは,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." eds, by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:坂本京子,川上久美子,原  巧,堀谷尚古,松木容彦,中込まどか,中尾美津男,北嶋美以子
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所
〒257 秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya (Study Director)
Kyoko Sakamoto,
Kumiko Kawakami,
Takumi Hara,
Naoko Horiya,
Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi,
Mitsuo Nakao, and Miiko kitashima
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627