チモールの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Thymol on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として,チモールについて,細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し,陰性の結果を得た.

検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvr Aの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により,用量設定試験を50.0〜5000 μg/プレートの用量で行ったところ,すべての検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験でともに抗菌性が認められた.したがって,本試験ではS9 mix無添加試験を15.6〜500 μg/プレート,S9 mix添加試験を62.5〜2000 μg/プレート(TA1535およびTA1537は31.3〜1000 μg/プレート)の範囲で用量を設定し,試験を実施した.

その結果,抗菌性は S9 mix無添加試験では,すべての検定菌で500 μg/プレート以上,また,S9 mix添加試験では,1000 μg/プレート(TA1535 およびTA1537では500 μg/プレート)以上の用量で認められた.復帰変異コロニー数は,用いたすべての検定菌について,2回の本試験でともに,いずれの用量においても,2回の本試験でともに増加は認められなかったことから,チモールは,用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた.

E. coli WP2 uvrA株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.

検定菌は− 80℃以下で凍結保存したものを用い,ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

〔被験物質〕

チモール (CAS No. 89-83-8)は,分子量 150.22 の白色結晶である.試験には,和光純薬工業(株)製[ロット番号:CAN1119,純度 98%以上(不純物:不揮発物 0.05%以下および他のフェノール類を限度内含有)]のものを購入して,使用時まで室温で保管して用いた.

チモールは,ジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解性が良いことから,DMSOに20.0 mg/mlまたは50.0 mg/mlになるように溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.

試験の開始に先立って,チモールの DMSO溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,本試験気把汗修靴芯稠仕(156 μg/ml)溶液および高濃度(20.0 mg/ml)溶液について,室温遮光条件下で安定性を調べた.その結果,調製4時間後における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して101および102%であった.また,含量測定試験を行った結果,調製液の濃度は,それぞれ低濃度は95.7%,高濃度は97.5%であった.

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.

AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2, 2AA は DMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを−20℃で凍結保存し,用時解凍した.9AA は DMSO に,SA は純水に溶解し,速やかに試験に用いた.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1) トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー(Difco)0.6%
塩化ナトリウム0.5%
(B)* L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5 mM

*:WP2 uvrA 用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
バクトアガー(Difco)15 g
径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

1 ml中下記の成分を含む
S9**0.1 ml
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコース-6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol

**:7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた.

〔試験方法〕

プレート法により, S9 mix無添加試験およびS9 mix添加試験を行った.

小試験管中にトップアガー 2 ml,被験物質調製液0.1 ml,リン酸緩衝液0.5 ml(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 ml),検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.

用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った.

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において,被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が,溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し,かつ,その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした.

結果および考察

〔用量設定試験〕

50.0〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として,試験を実施したところ,S9 mix無添加試験では5菌株すべてにおいて,500 μg/プレート以上で抗菌性が認められた.また,S9 mix添加試験ではTA1535とTA1537が500 μg/プレート以上で,その他は1500 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められた.

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1,2に示した.チモールの用量を,S9 mix無添加試験では15.6 〜500 μg/プレート,S9 mix添加試験では62.5 〜2000 μg/プレート(TA1535 およびTA1537は31.3〜1000 μg/プレート)の範囲で公比を2として設定し,試験を実施した.

2回の試験のいずれにおいても,用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において,溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果に基づき,チモールは,用いた試験系において変異原性を有しないもの (陰性)と判定した.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." eds, by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:坂本京子,川上久美子,原  巧,清水ゆり,松木容彦,中込まどか,飯田さやか
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所
〒257 秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya (Study Director)
Kyoko Sakamoto,
Kumiko Kawakami,
Takumi Hara, Yuri Shimizu,
Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi,
Sayaka Iida
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627