o-sec-ブチルフェノールのラットを用いる単回経口投与毒性試験
Single Dose Oral Toxicity Test of o-sec-Butylphenol in Rats
要約
o-sec-ブチルフェノールの単回経口投与毒性試験を，1群5匹からなる5週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD)雌雄ラットを用いて実施した．
投与量には雌雄とも0(コーンオイル)，250，500，1000および2000 mg/kgを設定し，観察は投与日を観察第1日として投与後14日間行った．死亡例については発見後速やかに，生存例については観察第15日に屠殺して剖検し，以下の成績を得た．
雄の1000 mg/kg以上の投与群では全例が，雌の1000 mg/kg以上の投与群では各4例がそれぞれ死亡した．死亡はいずれも投与翌日の観察前までに認められた．
雌雄とも自発運動の低下あるいは腹臥位，側臥位またはうずくまり姿勢が被験物質投与群の殆どの例で認められた他，少数例では歩行異常がみられた．症状の経過は迅急性で，投与後1時間以内に発現し，早い例では投与後2時間の観察までに回復した．死亡例ならびに生存例の各1例ではこれらの症状の他，呼吸数の減少，異常呼吸音，呼吸促迫，流涎等の症状がみられた．
体重測定の結果，雌の生存例では1000 mg/kg以上の投与群で観察第2日に体重増加の抑制が認められたが，観察第4日の測定以降，回復傾向を示した．雄の生存例には，被験物質投与による体重推移への影響は認められなかった．
病理学的検査の結果，死亡例では肺の赤色領域あるいは暗赤色部，全身の被毛の湿潤がみられた．観察期間終了時剖検例では前胃粘膜の白濁肥厚部が認められ，2000 mg/kg投与群の1例では前胃漿膜面と脾臓の一部との癒着が認められた．
以上のことから，本試験条件下ではo-sec-ブチルフェノールの雌雄ラットにおけるLD50値は500〜1000 mg/kgの間にあると推定され，経口投与時の標的器官は呼吸器ならびに消化管であることが推定された．
方法
1．被験物質および投与検体の調製法
被験物質は，本州化学工業(株)(和歌山)より提供されたo-sec-ブチルフェノール(ロット番号:970922，純度:99.15 %，融点:15.7℃，沸点:227℃，無色透明液体)を使用し，入手後，使用時まで遮光し室温に保管した．試験に使用した被験物質の残余は試験終了後，提供者により純度を測定し，試験期間中安定であったことを確認した．
投与に使用する検体の調製においては必要量の被験物質を秤量し，コーンオイル(ロット番号:V7R2020，ナカライテスク(株))を加えて溶解させ，投与時まで室温で遮光保管した．なお，被験物質は2.00および200 mg/mLの濃度になるようコーンオイルで溶解した状態で，調製後8日間は安定であり，また，各投与検体中の平均含量は所定濃度の規定範囲内にあることが確認された．
2．投与量の設定および投与方法
本試験における投与量は，予備試験の結果を基に決定した．すなわち文献検討の結果，o-sec-ブチルフェノールのマウス単回投与時のLD50値は，腹腔内投与では63 mg/kg，静脈内投与では60〜80 mg/kg1)であり，モルモットにおける単回経口ならびに単回経皮投与時のLD50値は600〜2400 mg/kg2)であった，ラット経口投与時のLD50値は，ほぼこの両者の範囲内にあるものと考え，1群3匹からなる雌雄ラットにo-sec-ブチルフェノールの30，100，300および1000 mg/kgを単回経口投与した．その結果，雌雄とも1000 mg/kg投与群では，投与直後から自発運動の低下，側臥位姿勢，正向反射の消失，体温の低下が認められ，雄の1例，雌の2例が死亡した．死亡例では死戦期に，1秒程度の間隔の軽度な痙攣あるいは振戦，チアノーゼが認められた．300 mg/kg投与群では，雌雄とも歩行異常，側臥位姿勢，自発運動の低下等がみられたが死亡は認められなかった．100 mg/kg以下の投与群では，被験物質投与によると考えられる異常は認められなかった．以上の結果から，1000 mg/kgの投与は明らかな毒性発現量，300 mg/kgは軽度毒性量であることが推定された．そこで本試験では，確実な死亡発現量と想定される2000 mg/kgを最高用量，単回投与では動物の死亡は認められないと推定される250 mg/kgを低用量とした．また，両者の間に公比2で500 mg/kg投与群と1000 mg/kg投与群を設けた．さらに，媒体がコーンオイルであることからコーンオイルを同容量投与する溶媒対照群を設定した．
投与容量は，体重1 kg当たり10 mLとし，動物をあらかじめ約18時間絶食させた後，投与直前に測定した体重を基に投与液量を計算し，ラット用胃管を用いて強制的に単回経口投与した．投与は午前10時〜11時の間に行い，給餌は投与後約4時間に再開した．
3. 使用動物および飼育方法
4週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD, SPF)雌雄ラットを，日本チャールス・リバー(株)厚木飼育センターから購入し，飼育環境への馴化と検疫を兼ねて6日間飼育した．
全飼育期間を通じ，動物を金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し，温度23.5〜25.0℃，湿度54〜66 %，換気回数約15回/時，照明12時間(7時〜19時点灯)に制御された飼育室で，固型飼料(CE-2，日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した．
4. 群構成
試験には予備飼育中の一般状態に異常が認められなかった雌雄各25匹を用い，投与前日の測定体重を基に体重別層化無作為抽出法により1群雌雄各5匹からなる5群に分け，5週齢で使用した．
5. 観察および検査
投与日を観察第1日とし，投与後14日間にわたって死亡の有無を確認し，各動物の一般状態を観察した．観察は投与日においては投与直後から2時間まで連続して行った．以降は投与後6時間まで約1時間間隔で実施した．観察第2日から15日までは毎日1回行った．体重は全例について，投与直前，観察第2，4，8，11および15日に測定した．投与後の死亡例については，発見次第体重を測定した後，速やかに剖検した．また，観察第15日に生存例全例をペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血屠殺して剖検した．
結果
1. 死亡動物(Table 1)
雄では1000 mg/kg以上の投与群で各5例全例が，雌では1000 mg/kg以上の投与群で各4例が死亡した．死亡はいずれも観察第2日の観察時までに認められた．
2. 一般状態
雌雄とも自発運動の低下あるいは腹臥位，側臥位またはうずくまり姿勢が，被験物質投与群の殆どの例で認められ，少数例では歩行異常もみられた．症状の経過は迅急性で，投与後1時間以内に発症し，早い例では投与後2時間以内に，遅い例でも2000 mg/kg投与群の雌の1例を除いて観察第2日の観察開始までに回復した．死亡例ならびに2000 mg/kg投与群の雌の生存例の1例ではこれらの症状の他，呼吸数の減少，異常呼吸音，呼吸促迫，流涎，全身の被毛の湿潤等の症状がみられた．
3. 体重測定
雌の生存例では，1000 mg/kg以上の投与群で，観察第2日に体重増加の抑制が認められたが，観察第4日の測定以降，回復傾向を示した．雄の生存例には，いずれの投与群にも被験物質投与による体重推移への影響は認められなかった．
4. 病理学検査
死亡例では，肺の赤色領域あるいは暗赤色部が，投与第1日に死亡した2000 mg/kg投与群の雄1例および投与第2日に死亡した2000 mg/kg投与群の雌1例に認められた．観察期間終了時剖検例では，前胃粘膜の白濁肥厚部が，雌の2000および1000 mg/kg投与群の各1例，500 mg/kg投与群の2例に観察され，2000 mg/kg投与群の1例では，前胃漿膜面と脾臓の一部との癒着が認められた．
考察
o-sec-ブチルフェノールの250，500，1000および2000 mg/kgを1群5匹からなる5週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD)雌雄ラットに単回強制経口投与したところ，雄では1000 mg/kg以上の投与群で各5例全例が，雌では1000 mg/kg以上の投与群で4例がそれぞれ死亡したことから，本試験条件下では被験物質の雌雄ラットにおけるLD50値は，500〜1000 mg/kgの間にあると推定された．
本試験で認められた自発運動の低下、腹臥位，側臥位またはうずくまり姿勢は，いずれも迅急性に経過した．すなわち，いずれの症状も投与後1時間以内に発症し，早い例では投与後2時間以内に回復した．また，死亡も，いずれも投与翌日の観察前までに認められた．
死亡例では，呼吸数の減少，異常呼吸音，呼吸促迫，流涎等の症状がみられ，生存例の1例でも投与当日，呼吸数の減少，流涎が認められた．さらに，剖検の結果，死亡例では肺の赤色領域あるいは暗赤色部が認められたことから，経口投与時の標的器官の一つとして呼吸器が考えられた．また，観察期間終了時剖検例では前胃粘膜の白濁肥厚部が観察され，1例では前胃漿膜面と脾臓の一部との癒着が認められたことから消化管に対する影響も疑われた．
文献
| 1) | R. James, J. B. Glen., Journal of Medicinal Chemistry, 23, 1350(1980). |
| 2) | "o-sec-BUTYLPHENOL. in Documentation of the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices." Fifth Edition, American Conference of Governmental Industrial Hygienists Inc., Cincinnati, 1986, pp. 84. |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 大原直樹 |
| 試験担当者： | 高島宏昌，松本浩孝，一原佐知子，稲田浩子，永田伴子，畔上二郎，安生孝子，三枝克彦 |
| (財)食品薬品安全センター 秦野研究所 |
| 〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5 |
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | |
| Correspondence |
| Authors: | Naoki Ohara(Study director)
Hiromasa Takashima, Hirotaka Matsumoto, Sachiko Ichihara, Hiroko Inada, Tomoko Nagata, Jiro Azegami, Takako Anjo, Katsuhiko Saegusa |
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center |
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan |
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | |