1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンのラットを用いる
経口投与簡易生殖毒性試験

Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test of
1,4-Dichloro-2-nitrobenzene by Oral administration in Rats

要約

 既存化学物質の毒性学的性質を評価するために,1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンのラットを用いる経口投与による簡易生殖毒性試験を行い,雌雄動物の性腺機能,交尾行動,受胎および分娩などの生殖発生に及ぼす影響について検討した.投与段階は,0(媒体),6,20,60 および 200 mg/kgとした.

機ト辛投与毒性

1.雄(P)に及ぼす影響

 一般状態の観察では,60 および 200 mg/kg群で黄褐色尿および流涎が投与初期から最終投与日あるいは剖検日まで少数例〜全例にみられた.その他に,200 mg/kg群では下腹部の被毛の汚れ,自発運動の低下,後肢の伸展が少数例〜全例にみられた.体重は,200 mg/ kg群で投与期間の初期から有意な増加抑制が認められた.剖検では,200 mg/kg群で精巣の小型・軟化が全例にみられた.器官重量では,200 mg/kg群で精巣および精巣上体の絶対重量ならびに相対重量がともに有意な低値を示した.病理組織学的検査では,200 mg/kg群で精巣の精細管上皮の変性を主体とする変化が全例にみられた.また,精巣上体では管腔内の残屑がみられた.

2.雌(P)に及ぼす影響

 一般状態の観察では,60 および 200 mg/kg群で黄褐色尿および流涎が投与初期から最終投与日あるいは剖検日まで少数例〜全例にみられた.また,200 mg/kg群では下腹部の被毛の汚れ,自発運動の低下,よろめき歩行,腹臥あるいは横臥,呼吸緩徐,後肢の伸展,斜頸などの症状がみられ,妊娠期間中に 1 例(死亡胎児 13 例確認),分娩期間中に 1 例(死亡胎児 9 例確認),哺育期間中に 4 例が死亡した.体重は,200 mg/kg群で妊娠後期および哺育 4 日に有意な増加抑制が認められた.摂餌量は,200 mg/kg群で哺育期間に有意な低値が認められた.剖検では,200 mg/kg群の生存例で胸腺および脾臓が小型であった.死亡例では,胸腺の小型化・暗赤色化,肺および肝臓の暗赤色化,脾臓の小型化,腺胃粘膜の暗赤色斑などの変化がみられた.病理組織学的検査では,対照群および 200 mg/kg群の卵巣に著変はみられなかった.一方,200 mg/kg群の生存例では胸腺の萎縮,脾臓で白脾髄の細胞数減少が,死亡例では胸腺の萎縮・出血,脾臓のリンパ性萎縮・白脾髄辺縁帯の細胞数減少,肺および肝臓のうっ血,腺胃粘膜の潰瘍などの変化がみられた.

供ダ舷H生毒性

1.親動物(P)の生殖発生に及ぼす影響

 交配開始前の発情回数,交尾率,受胎率および妊娠期間は,各投与群とも対照群と同程度であった.分娩状態は,対照群および 20 mg/kg以下の投与群では異常はみられなかった.一方,60 mg/kg群の 1 例では死亡児のみの出産であった.また,200 mg/kg群の 1 例は妊娠 20 日に,1 例は分娩途中に死亡した.その他に,同群では 7 例で哺育不全が観察された.黄体数,着床痕数,着床率,新生児出産雌数および出産率は,各投与群とも対照群との間に有意差は認められなかった.

2.新生児(F1)に及ぼす影響

 総出産児数,分娩率,死産児数,新生児数,出生率および性比には,各投与群とも対照群との間に有意差は認められなかった.哺育 4 日の生存児数は,60 mg/kg以下の投与群は対照群とほぼ同程度であったが,200 mg/kg群では有意差は認められなかったものの,低値であった.一般状態では,200 mg/kg群の 7 例(哺育不全がみられた母動物)の新生児で表皮温下降が観察された.哺育 4 日の生存率は,60 mg/kg以下の投与群では対照群とほぼ同程度であったが,200 mg/kg群では哺育期間中の新生児死亡数が多く,有意な低値を示した.体重は 200 mg/kg群で雌雄ともに哺育 0 日および 4 日とも低値であり,雄では両日とも有意差が認められた.

 以上により,1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは 60 mg/kg以上の群で周産期の母動物に,さらに 200 mg/kg群で授乳期の母動物に影響を及ぼしている可能性が考えられた.また,200 mg/kg群では新生児の発育に対する影響がうかがわれた.したがって,当試験条件下における生殖発生毒性学的な無影響量は雄の生殖に関しては 200 mg/kg,雌の生殖に関しては 20 mg/kg,児動物の発生に関しては 60 mg/kgと推察された.

方法

1.被験物質,媒体および投与検体液

 被験物質の 1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは,分子量:192.00,融点:55 ℃,沸点:267 ℃で油溶性の固体である(Lot No. 309001,製造元:日本化薬(株),純度:99.5 %以上).投与終了後に残余被験物質の一部を製造元に送付して分析した結果,純度は99.5 %以上であり,使用期間中の安定性が確認された.媒体として,コーンオイルを用いた.

 投与検体液は,被験物質をコーンオイルに溶解して調製した.投与開始前および投与期間終了前の 2 回,試験施設内で HPLC 法により各投与検体液中の被験物質濃度を測定した.その結果,被験物質濃度は適正範囲内の値を示した.コーンオイル中の 2,20 および200 mg/ml濃度の被験物質は,調製後冷蔵・遮光下で 7 日間,さらに室温・遮光下で 4 時間保存条件で安定であることが確認された.そこで,当濃度範囲内の投与検体液の調製は1 週間に 1 回以上とし,1 日分毎に分割して冷蔵・遮光下で保存し,用時室温に戻して投与に用いた.当濃度範囲外の投与検体液は用時調製とし,調製後は速やかに投与に用いた.

2.使用動物および飼育条件

 8 週齢の Sprague-Dawley 系雌雄ラット[Crj:CD(SD),(SPF)]を日本チャールス・リバー(株)日野飼育センターから購入した.5 日間の検疫期間およびその後 6 日間の馴化期間を設け,一般状態および体重推移に異常がみられず,また性周期観察で異常が認められない雌雄各 60 匹の動物を群分けして試験に用いた.群分けは,コンピュータを用いて体重を層別に分けた後に,無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように,投与開始日の前日に行った.

 動物は,室温 20〜24 ℃,湿度 40〜70 %,明暗各 12 時間,換気回数 12 回/時に設定した飼育室で飼育した.検疫・馴化期間中はステンレス製懸垂式ケージを用いて 1 ケージあたり 4 匹までの群飼育とし,群分け後はステンレス製五連ケージを用いて個別飼育した.ただし,交配はステンレス製懸垂式ケージ内で行った.また,母動物は妊娠 18 日に床敷(サンフレーク,日本チャールス・リバー(株)を入れたプラスチック製ケージに個別に移し,自然分娩および哺育させた.床敷の分析成績は,当試験施設で定めた基準値の範囲内であった.

 飼料は,固型飼料(CRF-1,オリエンタル酵母工業(株))を給餌器に入れ,自由に摂取させた.飲料水は,水道水を給水瓶を用いて自由に摂取させた.飼料および飲料水の分析の結果,いずれも検査成績は試験施設で定めた基準値の範囲内であった.

3.投与経路,投与方法,群構成および投与量

 1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは継続して経口的に人に摂取される可能性が考えられるため,投与経路として経口投与を選択した.投与液量は,雄では投与日に最も近い測定日の体重を基準とし,5 ml/kgで算出した.雌では,交配前および交配期間中は投与日に最も近い測定日の体重を,妊娠期間中は妊娠 0,7,14 および 21 日の体重を,哺育期間中は哺育 0 日の体重を基準とし,5 ml/kgで算出した.投与開始時の週齢は雌雄とも約 10 週齢,体重範囲は雄が 368〜407 g,雌が 201〜234 gであった.

 群構成は,以下の如くとした.一群の動物数は,雌雄各 12 匹とした.

 投与量設定の理由:雄ラットを用いた投与量設定のための 2 週間経口投与による予備試験(投与量:0,62.5,125,250,500 および 1000 mg/kg,1 群 5 匹)の結果,1000 mg/kg群では投与 4 日までに,500 mg/kg群では投与 6 日までに全例が死亡した.250 mg/ kg群では,投与 3〜9 日以降に流涎,黄褐色尿,下腹部の被毛の汚れなどの症状がみられ,体重は増加抑制傾向で剖検日には有意差が認められた.さらに,投与 14 日には 1 例が死亡し,剖検では精巣が小型であった.また,125 mg/kg群でも投与 4 日以降には流涎および黄褐色尿がみられた.

 そこで,今回の試験では投与期間を考慮して,予備試験で一般状態,体重および剖検に影響がみられた 250 mg/kgをやや下まわる 200 mg/kgを最高用量とし,以下公比約 3 で 60,20 および 6 mg/kg群を設定した.対照として,同一液量の媒体投与群を設けた.

 投与期間は,雄では交配前 14 日間およびその後 35 日間の合計 49 日間とし,雌では交配前 14 日間,交配期間中(最長 6 日間),妊娠期間および哺育 4 日の剖検の前日(41〜46日間)までとした.投与は 1 日 1 回で連日とした.

4.観察および検査項目

1) 雄(P)

(1) 一般状態および死亡の有無

 投与期間中は毎日投与前・後の 2 回観察した.

(2) 体重

 1 週間に 2 回および剖検日に測定した.

(3) 摂餌量

 交配開始前 14 日間および交配期間終了後に,1 週間に 2 回,連続 2 日間量を測定して 1 日量に換算した.

(4) 剖検

 投与期間(49 日間)終了の翌日に,エーテル麻酔下で腹大動脈より放血致死させた後に,器官・組織の肉眼的観察を行った.精巣および精巣上体を摘出して重量を測定し,ブアン液に固定した.

(5) 病理組織学的検査

 精巣および精巣上体は,全例について常法に従ってパラフィン包埋後に H-E 染色組織標本を作製し,病理組織学的検査を行った.

2) 雌(P)

(1) 一般状態および死亡の有無

 投与期間中は毎日投与前・後の 2 回観察した.死亡例(No. 453,455,458,459,461,462)は発見後速やかに剖検し,着床痕数および黄体数を数えた.子宮,卵巣および異常の認められた器官・組織,ならびに胎児は 10 %中性緩衝ホルマリン液に固定し,保存した.

(2) 性周期

 投与開始日から交尾確認日まで毎日 1 回観察した.なお,発情期が連続 2 日間にわたって観察される場合は 1 回と数えた.

(3) 体重

 交配開始前 14 日間および交配期間中は毎週 2 回,妊娠期間中は妊娠 0,7,14 および 21 日に,哺育期間は哺育 0 および 4 日にそれぞれ測定した.

(4) 摂餌量

 交配開始前 14 日間は,1 週間に 2 回連続 2 日間量を測定して 1 日量に換算した.また,妊娠期間中は妊娠 0,7,14 および 19 日からの連続 2 日間量を,哺育期間中は哺育 0〜4 日の累積量を測定し,それぞれ 1 日量に換算した.

(5) 分娩状態の観察

 自然分娩させ,分娩状態の異常の有無および分娩終了の確認を妊娠 21 日から妊娠 25 日の午前 10 時まで毎日行った.午前 10 時までに分娩が終了していた場合,その日を哺育 0 日とした.

(6) 交尾確認後 25 日の午前 10 時までに分娩しない動物

 エーテル麻酔下で腹大動脈より放血致死させた後に剖検し,妊娠の成否を確認した.着床がみられなかった雌(No. 053,256,460)は,不妊動物とした.子宮および卵巣を摘出して,10 %中性緩衝ホルマリン液に固定し,保存した.

(7) 哺育状態の観察および剖検

 哺育 4 日まで毎日観察し,哺育 4 日にエーテル麻酔下で腹大動脈より放血致死させた後に剖検して,着床痕数および黄体数を数えた.子宮,卵巣および剖検で異常の認められた器官・組織を摘出して,10 %中性緩衝ホルマリン液に固定し,保存した.

(8) 全新生児が死亡した母動物の処置

 全新生児が死亡した母動物(No. 155,454,457)は,発見後速やかにエーテル麻酔下で腹大動脈より放血致死させた後に剖検し,着床痕数および黄体数を数えた.子宮および卵巣を摘出して,10 %中性緩衝ホルマリン液に固定し,保存した.

(9) 病理組織学的検査

 卵巣は,全例について常法に従ってパラフィン包埋標本を作製した.その後,対照群および 200 mg/kg群については H-E 染色組織標本を作製し,病理組織学的検査を行った.さらに,剖検時に異常が認められた器官・組織(胸腺,肺,肝臓,脾臓,胃)の代表例についても同様に検査した.

3) 親動物(P)の生殖発生に及ぼす影響

 被験物質を 14 日間にわたって投与した約 12 週齢の同一群内の雌雄を,1 対 1 の組み合わせで同居交配した.交配期間は,14 日を限度として交尾を確認するまでの連続同居交配としたが,同居開始後 6 日までに全例の交尾が確認された.

 交尾確認は毎朝ほぼ一定時刻に行った.腟垢内に精子または腟栓を確認した雌を交尾動物とし,その日を妊娠 0 日として起算した.

4) 新生児(F1)

(1)出産時に,総出産児数と性,死産児数,新生児数および外表異常の有無を観察した.

(2)新生児について,一般状態および死亡の有無を生存期間中毎日 1 回観察した.

 死亡児および母動物が死亡した場合(No. 455:分娩途中,No. 453,459,461,462:哺育期間中)の全新生児は,剖検後に 10 %中性緩衝ホルマリン液に固定し,保存した.

(3) 体重

 哺育 0(出生日)および 4 日に測定した.

(4) 剖検

 哺育 4 日の観察終了後にエーテル麻酔下で腹大動脈から放血致死させた後,剖検した.

5.統計学的方法

 測定値の統計学的方法は下記の検定法を用い,有意差検定は対照群と被験物質各投与群との間で行った.いずれの検定の場合も危険率 5 %未満を有意とし,5 %未満(p<0.05)と 1 %未満(p<0.01)とに分けて表示した.不妊動物(No. 053,256,460)については,交尾後の体重および摂餌量は集計から除外した.また,分娩途中で死亡した母動物(No. 455)の新生児については,集計から除外した.新生児は,一腹の平均を一単位とした.

1) 多重比較検定

 体重,摂餌量,発情回数,同居日数,妊娠期間,着床痕数,黄体数,着床率,総出産児数,死産児数,分娩率,出生率,哺育 4 日の生存率,新生児数,性比,外表異常の出現率および器官重量(絶対重量および相対重量)について行った.

 検定では,Bartlett 法による等分散性の検定を行い,等分散の場合には一元配置法による分散分析を行い,有意ならば対照群との群間比較は Dunnett 法(例数が等しい場合)または Scheff法(例数が等しくない場合)により行った.一方,等分散と認められなかった場合は,順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallis の検定)を行い,有意ならば対照群との群間比較は順位を利用した Dunnett 法または Scheff法を用いて行った.

2) X^2 検定

 交尾率,受胎率および出産率について行った.

結果

機ト辛投与毒性

1.雄(P)に及ぼす影響

1) 一般状態

 対照群および 20 mg/kg以下の投与群では,観察期間を通じて異常症状は観察されなかった.

 60 mg/kg群では,黄褐色尿が投与 11 日の投与前から少数例にみられた.黄褐色尿を示す例数は投与の継続により徐々に増加し,投与 16 日からは剖検日まで全例にみられた.また,流涎が投与 11 日の投与直後には少数例に,その後は最終投与日まで少数例〜過半数例にみられた.なお,流涎は翌日の投与前には消失していた.

 200 mg/kg群では,60 mg/kg群でみられた黄褐色尿および流涎の他に,下腹部の被毛の汚れ,後肢の伸展および自発運動の低下がみられた.黄褐色尿は,投与 2 日の投与前から剖検日まで全例にみられた.流涎は初回投与直後には少数例に,投与 2 日には投与直後にほぼ全例に,投与 3 日からは最終投与日まで投与直後に全例でみられた.なお,流涎は翌日の投与前には消失していた.下腹部の被毛の汚れは投与 10 日には少数例に,その後は投与の継続により例数が徐々に増加し,投与 26 日からは剖検日まで全例にみられた.後肢の伸展は投与 19 日から 25 日に,当日の投与前から投与後にかけて少数例にみられた.自発運動の低下は,投与 34 日から最終投与日まで投与後に少数例〜ほぼ全例でみられた.その他には,異常症状は観察されなかった.

2) 体 重(Fig.1)

 200 mg/kg群では投与期間の初期から対照群に比して体重増加抑制がみられ,投与 8 日から剖検日まで有意差が認められた.同群では,ほぼ全例で投与 15 日から剖検日にかけて前回測定値に比して体重減少を示す日が 1〜6 回みられた.一方,60 mg/kg以下の投与群は対照群とほぼ同様の推移を示した.

3) 摂餌量

 各投与群とも摂餌量は対照群とほぼ同程度であり,いずれの測定日にも有意差は認められなかった.しかしながら,個別的には 200 mg/kg群では対照群の値のほぼ半量に留まる例が,投与期間の中期以降に散見された.

4) 剖検所見

 200 mg/kg群では,両側の精巣の小型化および軟化が全例にみられた.20 mg/kg群の 1 例(No. 206)でも同様の所見が得られた他に,対照群の 1 例(No. 003)では両側の精巣および精巣上体の軟化がみられた.その他の投与群では,著変はみられなかった.

5) 器官重量(Table 1)

 200 mg/kg群では,対照群に比して精巣および精巣上体の絶対重量ならびに相対重量がともに有意な低値を示した.60 mg/kg以下の投与群では,対照群とほぼ同程度であり有意差は認められなかった.なお,個別的には剖検で精巣に異常がみられた対照群および 20 mg/kg群の各 1 例で,精巣および精巣上体重量が同群の他の例に比して低値であった.

6) 病理組織学的検査(Table 2)

 精巣:軽度〜中等度の精細管上皮の変性およびごく軽度〜軽度の間質の水腫が,200 mg/kg群の全例にみられた.これらの内,ほぼ全例はごく軽度〜軽度の間細胞増生を,半数例は精細管にごく軽度〜軽度の巨細胞形成を伴っていた.なお,対照群の 1 例では中等度の精細管上皮の変性,ごく軽度の間質の水腫およびごく軽度の間細胞増生が,20 mg/kg群の1 例では高度の精細管上皮の変性,軽度の間質の水腫および軽度の間細胞増生がみられた.6 および 60 mg/kg群では,著変はみられなかった.

 精巣上体:管腔内に軽度〜中等度の残屑が 200 mg/kg群の過半数例にみられた.対照群および 20 mg/kg群の各 1 例では,管腔内の高度の精子消失がみられた.また,6 mg/kg群の 1 例では軽度の精子肉芽腫がみられた.60 mg/kg群では,著変はみられなかった.

2.雌(P)に及ぼす影響

1) 一般状態

 交配開始前および交配期間中:対照群および 20 mg/kg以下の投与群では,交配開始前および交配期間中を通じて異常症状は観察されなかった.60 mg/kg群では,黄褐色尿が投与11 日の投与前から交配終了日まで約半数例〜全例にみられた.また,流涎が投与 11 日の投与直後から交配開始日まで少数例にみられた.なお,流涎は翌日の投与前には消失していた.200 mg/kg群では,60 mg/kg群で観察された黄褐色尿および流涎の他に,下腹部の被毛の汚れがみられた.黄褐色尿は、投与 2 日の投与前から交配終了日まで全例にみられた.流涎は,投与初日の投与直後には少数例に,その後は交配終了日まで過半数例〜全例にみられた.なお,流涎は翌日の投与前には消失していた.下腹部の被毛の汚れは,交配期間中に半数例〜全例でみられた.

 妊娠期間中:対照群および 20 mg/kg以下の投与群では,異常症状は観察されなかった.60 mg/kg群では,交配開始前および交配期間中にみられた症状,すなわち黄褐色尿が全例に,流涎が投与直後から少数例〜約半数例に観察された.なお,流涎は翌日の投与前には消失していた.200 mg/kg群では,交配開始前および交配期間中にみられた症状に加えて自発運動の低下,よろめき歩行,腹臥あるいは横臥,呼吸緩徐,後肢の伸展,斜頸などの症状が観察され,死亡発現もあった.黄褐色尿は,全例にみられた.流涎は投与直後から全例にみられたが,翌日の投与前には消失していた.下腹部の被毛の汚れは,少数例〜全例にみられた.これらの症状以外に,1 例(No. 458)では妊娠 18 および 19 日には投与前から自発運動の低下がみられ,妊娠 20 日の投与前に死亡していた.1 例(No. 455)では,妊娠 22 日には投与前から自発運動の低下,後肢の伸展,斜頸が,投与後にはさらに腹臥,呼吸緩徐もみられ,妊娠 23 日(分娩途中)の投与前に死亡していた.1 例(No. 462)では,妊娠 21 日には投与前から自発運動の低下,よろめき歩行および斜頸がみられ,投与後にはよろめき歩行および自発運動の低下に替わって腹臥および呼吸緩徐がみられた.

 哺育期間中:対照群および 20 mg/kg以下の投与群では,哺育期間を通じて異常症状は観察されなかった.60 mg/kg群では,黄褐色尿が哺育 4 日の剖検日まで全例にみられた.また,流涎が投与直後に哺育 2 日まで少数例にみられたが,翌日の投与前には消失していた.1 例(No. 356)では死亡児のみの出産で新生児が得られなかったため,哺育 0 日に剖検した.200 mg/kg群では,妊娠期間中と同様の症状が観察された.黄褐色尿は,剖検日まで全例にみられた.流涎は投与直後にほぼ全例にみられたが,翌日の投与前には消失していた.下腹部の被毛の汚れは,剖検日まで約半数例〜少数例にみられた.妊娠期間中から腹臥,呼吸緩徐などの症状を示した 1 例(No. 462)では,哺育 0 日の投与前から横臥,呼吸緩徐,表皮温下降が,投与後も同様の症状が引き続いてみられ,午後の観察時には死亡していた.1 例(No. 459)では哺育 0 日には投与前から自発運動の低下がみられ,哺育 1 日には死亡していた.1 例(No. 461)では,哺育 0 日の投与前から自発運動の低下が,投与後には腹臥,呼吸緩徐がみられ,哺育 1 日には死亡していた.1 例(No. 453)では,哺育0 日の投与前から自発運動の低下が,哺育 1 日の投与前にはさらによろめき歩行,呼吸緩徐,後肢の伸展が,投与後には自発運動の低下およびよろめき歩行に替わって腹臥がみられ,哺育 2 日には死亡していた.その他に,哺育完了例(No. 451,452,456)でよろめき歩行,自発運動の低下が,哺育 1〜3 日の投与前から哺育 4 日の剖検前まで 1〜3 例にみられた.また,2 例(No. 454,457)では哺育 0〜2 日あるいは哺育 1〜3 日に自発運動の低下,よろめき歩行がみられ,前者は哺育 2 日に,後者は哺育 3 日に,いずれも新生児の全例が死亡したため,母動物を剖検した.

2) 体 重(Fig.2)

 交配前の投与期間中は,各投与群とも対照群とほぼ同様の推移を示した.一方,妊娠期間以降では 200 mg/kg群は増加抑制傾向であり,妊娠 14 および 21 日ならびに哺育 4 日には対照群に比して有意差が認められた.同群では,哺育 4 日の体重は生存した 3 例とも,哺育 0 日の体重よりも減少した.60 mg/kg以下の投与群では,妊娠期間中および哺育期間中とも対照群とほぼ同様の推移を示した.

3) 摂餌量

 交配前および妊娠期間中の摂餌量は,各投与群とも対照群とほぼ同様の推移を示した.一方,哺育期間中では 20 および 60 mg/kg群はやや高値,200 mg/kg群は低値であり,200 mg/kg群では対照群に比して有意差が認められた.なお,個別的には 200 mg/kg群で妊娠 21 日では 1 例(No. 462)の摂餌量は対照群の値のほぼ半量であり,哺育期間中では 1 例(No. 452)でほとんど摂餌が認められなかった.

4) 剖検所見

[生存例]

 200 mg/kg群(6 例)では胸腺の小型化が 5 例にみられ,その内の 1 例は脾臓の小型化を伴った.また,60 mg/kg群の 1 例(No. 356,死亡児のみの出産例)では肝臓の白色化がみられた.対照群および 20 mg/kg以下の投与群では,著変はみられなかった.

[死亡例]

 200 mg/kg群の 6 例中 5 例では,胸腺の小型化,暗赤色化,肺の暗赤色化,肝臓の暗赤色化,脾臓の小型化および腺胃粘膜の暗赤色斑などの変化がみられた.なお,妊娠 20 日の死亡例では著変はみられなかった.

5) 病理組織学的検査

(1) 生存例

[卵巣]

 対照群および 200 mg/kg群のいずれの例とも著変はみられなかった.

[胸腺]

 剖検で小型化を示した 2 例で,軽度〜中等度の萎縮がみられた.

[脾臓]

 剖検で小型化を示した 1 例では,白脾髄の中等度の細胞数減少がみられた。

(2) 死亡例

[卵巣]

 200 mg/kg群のいずれの例とも著変はみられなかった.

[胸腺]

 剖検で小型化および暗赤色化を示した 1 例では,中等度の萎縮と軽度の出血がみられた.

[脾臓]

 剖検で小型化を示した 2 例では,1 例で中等度のリンパ性萎縮が,1 例で白脾髄辺縁帯の軽度の細胞数減少がみられた.

[肺]

 剖検で暗赤色化を示した 1 例では,中等度のうっ血がみられた.

[肝臓]

 剖検で暗赤色を示した 1 例では,軽度のうっ血がみられた.

[胃]

 剖検で腺胃粘膜の暗赤色斑がみられた 1 例では,腺胃粘膜の軽度の潰瘍がみられた.その他に,死亡例では各器官・組織に死後変化が観察された.

II.生殖発生毒性

1.親動物(P)の生殖発生に及ぼす影響(Table 3,4)

1) 発情回数

 発情回数は,検疫・馴化期間内の 7 日間および投与期間中ともに各投与群とも対照群とほぼ同程度であり,有意差は認められなかった.

2) 交尾率,受胎雌数および受胎率

 対照群を含む各群の動物とも,同居開始後 6 日までに全例で交尾が確認された.交尾率は,対照群および各投与群とも 100%であった.交尾成立までの平均日数には,対照群と各投与群の間に有意差は認められなかった.

 受胎雌数は,対照群,20 および 200 mg/kg群では 12 例中 11 例であり,6 および 60mg/kg群では 12 例中 12 例であった.したがって,受胎率は対照群,20 および 200 mg/kg群では 91.7 %,6 および 60 mg/kg群では 100 %であり,各投与群とも対照群との間に有意差は認められなかった.

3) 妊娠期間,分娩状態および哺育行動

 妊娠期間は各投与群とも対照群とほぼ同程度であり,対照群との間に有意差は認められなかった.

 なお,前述の如く妊娠 20 日には 200 mg/kg群の 1 例(No. 458)が死亡した.また,同群の他の 1 例(No. 455)は分娩途中で死亡した.

 母動物の哺育状況の観察では,20 および 60 mg/kg群では異常はみられなかった.一方,6 mg/kg群の 1 例(No. 155)では哺育 1〜2 日に,200 mg/kg群の 2 例(No. 454,457)では哺育 1〜2 日あるいは哺育 1〜3 日に乳頭の発達不良,巣作り不良および授乳姿勢不良などの哺育不全がみられ,これらの例では哺育 3 日までに新生児の全例が死亡した.なお,対照群の 1 例(No. 051)では哺育 0 日に,200 mg/kg群の 1 例(No. 452)では哺育 1〜4 日に哺育不全が観察されたが,新生児の全例死亡には至らなかった.さらに,200 mg/ kg群の 4 例(No. 453,459,461,462)でも哺育 0 日あるいは哺育 1 日に哺育不全がみられ,いずれの母動物とも哺育 2 日までに死亡した.また,60 mg/kg群の 1 例(No. 356)では新生児はみられず,出産児の全例(7 例)が死亡児であった.

4) 黄体数,着床痕数および着床率

 黄体数,着床痕数および着床率には各投与群で投与用量に関連した変動はみられず,対照群との間に有意差は認められなかった.

5) 新生児出産雌数および出産率

 新生児出産雌数は,対照群および 20 mg/kg群は 11 例中 11 例,6 mg/kg群は 12 例中12 例で,出産率はいずれも 100 %であった.60 mg/kg 群では,12 例中 11 例で 91.7 %であった.また,200 mg/kg群は受胎雌数は 12 例中 11 例であったが,その内の 1 例は妊娠 22 日に死亡し,1 例は分娩途中に死亡したため,新生児出産雌数は 9 例中 9 例で出産率は 100 %であった.

2.新生児(F1)に及ぼす影響(Table 4)

1) 総出産児数,分娩率,死産児数,新生児数および出生率

 総出産児数,分娩率,死産児数,新生児数および出生率は,いずれも対照群との間に有意差は認められず,投与用量に関連した変動はみられなかった.

2) 性比および外表異常の観察

 性比は,各投与群とも対照群との間に有意差は認められなかった.また,新生児の外表観察では,いずれの例も異常はみられなかった.

3) 新生児の一般状態,哺育 4 日の生存率および剖検所見

 新生児の一般状態観察では,対照群,20 および 60 mg/kg群では,いずれも異常はみられなかった.対照群以外で哺育行動の不良が認められた母動物,すなわち 6 mg/kg群の 1例(No. 155),200 mg/kg群の 7 例(No. 452,453,454,457,459,461,462)の新生児では,哺育期間中に表皮温下降が観察された.

 哺育 4 日の剖検日までに,対照群では 1 母動物で 1 例(雄),6 mg/kg群では 4 母動物で 12 例(雄 7 例,雌 5 例),20 mg/kg群では 2 母動物で 2 例(雄),60 mg/kg群では 2 母動物で 2 例(雄)の新生児が死亡した.また,200 mg/kg群では新生児を出産した母動物は 9 例であり,その内で哺育 4 日まで生存した母動物は 5 例であった.しかしながら,その内の 2 例では新生児の全例が哺育期間中に死亡したため,哺育 4 日まで新生児を哺育した母動物は 3 例のみであった.同群では哺育 4 日の剖検日までに 5 母動物で42 例(雄 25 例,雌 17 例)の新生児が死亡した.したがって,哺育 4 日の生存率は対照群が 99.5 %であり,60 mg/kg 以下の投与群では 89.4〜98.8 %とほぼ同程度であったが,200 mg/kg群では 34.4 %で有意差が認められた.なお,哺育 4 日の新生児数は対照群が 13.3,60 mg/kg以下の投与群が 11.8〜14.5 に対して,200 mg/kg群では 4.0 と低値であったが,有意差は認められなかった.

 哺育 4 日の剖検では,いずれの生存児にも著変はみられなかった.

4) 新生児の体重(Fig.3)

 60 mg/kg以下の投与群の新生児の体重は,哺育 0 日および 4 日ともに,雌雄とも対照群とほぼ同程度であった.一方,200 mg/kg群では雌雄とも両日ともに低値であり,雄では哺育 0 日および 4 日とも対照群に比して有意差が認められた.

5) 未分娩胎児

 前述の如く,200 mg/kg群では妊娠 20 日に 1 例(No. 458)および分娩途中に 1 例(No. 455)の母動物が死亡した.剖検により,前者では雄 7 例と雌 6 例の死亡胎児が確認された.また,後者では雄 4 例と雌 3 例の新生児出産後に母動物が死亡したため,剖検したところ雄 5 例と雌 4 例の死亡胎児が子宮内に確認された.

考察

 1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンのラットを用いた簡易生殖毒性試験を実施した.投与量は 200 mg/kgを最高用量とし,以下 60,20 および 6 mg/kgとした.

 雄(P)に対しては,一般状態,体重,剖検および病理組織学的検査で被験物質投与の影響が認められた.一般状態では,60 mg/kg以上の投与群で投与後に流涎がみられたが,翌日の投与前には消失しており,一過性の症状であった.60 mg/kg以上の投与群でみられた黄褐色尿は,被験物質あるいはその代謝物の尿中排泄に関連した変化と考えられた.下腹部の被毛の汚れは,黄褐色尿の繰り返しの排泄に伴った変化と思われた.また,投与後にみられた自発運動の低下は翌日の投与前には消失しており,一過性の影響であった.さらに,後肢の伸展が 200 mg/kg群の少数例で投与期間の中期にみられたが,後肢の麻痺までは至らず,投与の継続により発現例数が増加することはなかった.体重は,200 mg/kg群では投与 2 週から有意な低値が認められた.対照群および 60 mg/kg以下の投与群では投与期間中に前回測定値に比して体重が減少する例はほとんどみられないのに対して,200 mg/kg群では投与 3 週以降にはほぼ全例で体重減少を示す日があった.摂餌量は,各投与群とも対照群との間に有意差は認められなかったものの,200 mg/kg群では対照群のほぼ半量の例が散見されることから,体重の増加抑制あるいは減少は,摂餌量の低値が一因と考えられた.器官重量は 200 mg/kg群で精巣および精巣上体重量が低値であり,剖検では精巣の小型化および軟化が,病理組織学的検査では精巣の精細管上皮の変性を主体とする変化と,精巣上体で精巣の変性に伴った変化と思われる管腔内の残屑がみられた.精巣および精巣上体の変化は最高用量群の全例にみられており,ニトロベンゼン系化合物に共通してみられる精巣毒性の影響と考えられた1-3).

 雌(P)に対しては,雄の同量投与群の場合とほぼ同様で 60 mg/kg以上の投与群で流涎,黄褐色尿,200 mg/kg群で下腹部の被毛の汚れ,後肢の伸展,自発運動の低下がみられ,その他によろめき歩行,腹臥または横臥,呼吸緩徐,斜頸などの症状がみられた.これらの症状は,ニトロベンゼン系化合物にみられる眼振,麻痺,振せん,正向反射消失,昏睡などの中枢および末梢神経に及ぼす影響に関連したものと考えられた1,2).さらに,200 mg/kg群では妊娠 20 日〜哺育 2 日の間に 6 例が死亡した.体重は妊娠期間の後期以降は有意な低値を示し,雄の場合と同様に摂餌量の低値が一因と考えられた.病理組織学的検査では,死亡例の 1 例のみではあるが腺胃の潰瘍が観察された.したがって,妊娠期間以降の摂餌量の低値,体重増加抑制あるいは減少には,消化管障害が関与している可能性が推察された.

 以上のように,一般毒性学的には 60 mg/kg以上の投与群で雌雄の一般状態(流涎),さらに 200 mg/kg群では雌雄の一般状態(自発運動の低下,後肢の伸展など)および体重に影響がみられ,雄の器官重量,剖検および病理組織学的検査(精巣,精巣上体)に異常所見が得られ,雌では死亡例もみられた.

 親動物(P)の生殖発生に関しては,発情回数,交尾率,受胎率,妊娠期間,着床痕数および出産率は,各投与群で被験物質投与の影響はみられなかった.

 雄動物では,前述の如く 200 mg/kg群の全例で精巣の組織変化が観察されたものの,12例全例で交尾が成立し,その内の 11 例で授胎能が確認されたことから,交尾成立までの15〜20 日間の投与では雄の交尾・授胎機能への影響は発現しないと思われた.なお,対照群および 20 mg/kg群の各 1 例でも精巣および精巣上体に最高用量群と同様の組織変化がみられた.当該例では,交尾は確認されたものの授胎能は認められず,不妊の原因はいずれも雄側にあると考えられた.60 mg/kg群では全例で精巣への影響は重量的にも組織学的にも認められていないことから,20 mg/kg群でみられた精巣の変化は被験物質投与との関連性のない偶発所見と思われた.

 雌動物では,妊娠 20 日に 200 mg/kg群の 1 母動物が死亡した.当動物では,上記のような摂餌量の低値に加えて妊娠による負荷が死亡原因と推測された.当例を含む 200 mg/kg群の胸腺,脾臓などにみられた組織変化も,被験物質投与に加えて妊娠の負荷による影響に起因するものと思われた.妊娠 22 日および分娩途中の死亡例の剖検では死亡胎児が合計 22 例認められたが,早期あるいは後期吸収胚はみられなかった.また,哺育期間中に 4 例の母動物が死亡した.さらに,3 母動物で哺育不全がみられ,2 母動物では新生児の全例が死亡した.すなわち,200 mg/kg群では 12 例中で受胎雌数は 11 例,新生児出産雌数は 9 例であり,その内で哺育 4 日までの哺育完了動物数は 3 例のみであった.これらの結果から,1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは周産期および授乳期の母動物に対して影響を及ぼしていると考えられた.また,60 mg/kg群の 1 母動物では出産児は死亡児のみであった.当群では,200 mg/kg群でみられたような母動物の死亡はないものの,死産児のみで新生児がみられなかったことは,被験物質が周産期の母動物に対して影響を及ぼした結果と推測された.一方,6 mg/kg群の 1 母動物で新生児の全例が死亡したが,20 mg/kg群では同様の変化はみられず,また母動物の死亡,あるいは死産児のみで新生児が得られないなどの影響がみられないことから,6 mg/kg群の新生児の死亡は被験物質投与との関連性のない所見と考えられた.

 新生児に対しては,出産児数,分娩率,死産児数,新生児数,出生率および性比には被験物質投与の影響はみられなかった.また,哺育 4 日の剖検では異常はみられなかった.一方,200 mg/kg群では新生児の多くが死亡し,哺育 4 日の生存率は有意な低値を示した.また,体重は雌雄ともに低値であり,雄では有意差が認められた.したがって,当被験物質は新生児の発育に対して影響を及ぼしていると考えられた.

 以上のように,1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは 60 mg/kg以上で周産期の,さらに 200 mg/kgでは授乳期の母動物に対して影響を及ぼした可能性が考えられた.また,200 mg/kg群では新生児の死亡数が多く,哺育 4 日の生存率が低値であり,哺育 4日の雌雄の生存児の体重が低値であった.したがって,当試験条件下における生殖発生毒性学的な無影響量は,雄の生殖に関しては 200 mg/kg,雌の生殖に関しては 20 mg/kg,児動物の発生に関しては 60 mg/kgと推察された.

文献

1)R.O. Beauchamp, Jr., et al., CRC Crit. Rev.Toxicol., 11, 33-84(1983).
2)T.E. Cody et al., J.Toxicol.Environ.Health, 7, 829-847(1981).
3)B.S. Levine et al., Toxicology, 32, 253-265(1984).

連絡先
試験責任者:和田 浩
試験担当者:小林吉一,藤村高志,岡田雅昭,
牧野浩平,山本明義
(株)日本バイオリサーチセンター 羽島研究所
〒 501-62  岐阜県羽島市福寿町間島 6-104
Tel 058-392-6222Fax 058-391-3171

Correspondence
Authors:Hiroshi Wada(Study director)
Yoshikazu Kobayashi, Takashi Fujimura,
Masaaki Okada,
Kohei Makino and Akiyoshi Yamamoto
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6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-62 Japan
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