o-トルエンスルホンアミドのラットを用いる経口投与簡易生殖毒性試験

Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test of o-Toluenesulfonamide
by Oral Administration in Rats

要約

o-トルエンスルホンアミドの0,4,20および100 mg/kgを雌雄のSprague-Dawley系[Crj:CD(SD)IGS,SPF]ラットの交配前2週間および交配期間ならびに雄では交配期間終了後剖検前日まで,雌では妊娠期間を通して哺育3日まで経口投与し,雌雄ラットに対する生殖毒性について検討した.

その結果,親動物には,いずれの投与群においても死亡はみられなかった.一般状態の変化として,100 mg/kg投与群において,雌雄とも投与直後に活動性の低下および流涎が観察され,体重増加が抑制された.剖検所見および病理組織学検査では,投与によると考えられる異常は認められなかった.

生殖発生毒性に関しては,性周期,交尾および受胎能力,妊娠期間,分娩ならびに哺育状態に投与に起因したと考えられる変化は認められなかった.出生児に関しても,生存性および体重に投与の影響は認められなかった.

以上の成績から,本試験条件下におけるo-トルエンスルホンアミドの親動物に対する無影響量は20 mg/kg/day,親動物の生殖能力および出生児に対する無影響量は100 mg/kg/dayと判断される.

方法

1. 被験物質

使用したo-トルエンスルホンアミドは,富士アミドケミカル(株)(東京)から提供された(ロット番号:CHCI-7,純度:99.95 wt%).入手した被験物質は使用時まで室温で保管した.なお,試験期間中の被験物質の安定性は,提供前および返却後(試験終了後)の被験物質の品質試験を提供元で実施することにより確認した.

被験物質は,0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液[日本薬局方カルメロースナトリウム,ロット番号6Z09,丸石製薬(株)および注射用水,ロット番号9707SA,光製薬(株)]に懸濁して投与検体とした.投与検体は,週1回の頻度で調製し,使用時まで冷蔵,気密の条件下で保管した.投与検体中の被験物質は,各濃度の含量測定および均一性試験の結果から,所定濃度が均一に含有されていることを確認した.

2. 使用動物および飼育条件

7週齢のSprague-Dawley系[Crj:CD(SD)IGS,SPF]ラットを日本チャールス・リバー(株)から購入し,馴化と検疫を兼ねて入荷後14日間,予備飼育した.予備飼育中に雌は毎日膣スメアを採取し,性周期が4日周期を示した動物のみを選出し,雌雄ともに一般状態に異常がなかったものを使用した.動物は温度22〜25 ℃,湿度50〜65 %,換気回数約15回/時,照明12時間(午前7時〜午後7時)に制御された飼育室で,金属製金網床ケージに個別に収容して飼育し,固型飼料(CE-2,日本クレア(株))および飲料水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した.妊娠14日(精子観察日=妊娠0日)以後の動物は,床敷として紙パルプ製チップ(ALPHA-dri加商(株))を入れたプラスチック製ラット用繁殖ケージに収容した.

3. 投与量の設定および投与方法

投与量は,先に実施された反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験1)の結果をもとに設定した.すなわち,雌雄ラットに0,20,100および500 mg/kgのo-トルエンスルホンアミドを交配前2週間および交配期間2週間,さらに,雄では交配期間終了後2週間,雌では妊娠期間を通して哺育3日まで投与を継続した結果,100 mg/kg以上の投与群において自発運動の低下,流涎が認められ,体重増加および摂餌量の抑制がみられたことから,高用量には100 mg/kgを設定し,公比5で減じて中用量には20 mg/kgを,低用量には4 mg/kgを設定した.対照群には被験物質の媒体である0.5 % CMC Na水溶液を用いた.投与容量は体重1kg当たり5 mLとした.群構成は,雌雄とも検疫終了日の体重を基に体重別層化無作為抽出法により各群雌雄13匹を配した.投与期間は,雄に対しては交配前14日間と交配期間14日間および交配期間終了後19日間の47日間,雌に対しては交配前14日間と最長14日間の交配期間中(交尾まで)ならびに交尾雌では妊娠期間を通して分娩後の哺育3日(分娩日=哺育0日)まで(41〜44日間),また,交尾後,分娩しなかった雌は妊娠26日相当日まで(41〜44日間),交尾しなかった雌は剖検前日まで(54日間)とし,毎日1回,9時〜12時の間に投与した.各動物の投与液量は,雄ならびに交配前および交配期間中の雌では週1回測定した体重を基に,交尾した雌では最新の測定日の体重を基に算出した.

4. 検査項目

1) 親動物

(1) 一般状態

飼育期間中,毎日1回以上観察した.

(2) 体重測定

雄および交配前の雌では,投与期間中週1回および解剖日に測定した.交尾した雌は妊娠0,7,14,20日に,分娩した雌は哺育0および4日に測定した.

(3) 摂餌量測定

投与期間中(交配期間を除く)週1回,体重測定日と同じ日に給餌量を測定し,その翌日に残餌量を測定し,1 日の摂餌量を算出した.交尾した雌では妊娠0,7,14ならびに20日,分娩した雌では哺育1ならびに3日から翌日までの摂餌量を測定した.

(4) 性周期および交配

検疫期間に引き続いて投与開始日以降も,毎日,腟スメアを採取して,性周期を観察した.交配は,投与15日の夕方から最長2週間,同群内の雌雄を1対1で連続同居させて行った.交尾の確認は毎朝,腟栓あるいは腟スメア中の精子の確認により行い,交尾が確認された雌については,その日を妊娠0日とするとともに,雄から分離し個別に飼育した.交配結果および妊娠の成否により,交尾率〔(交尾動物数/同居動物数)×100〕,受胎率〔(受胎動物数/交尾動物数)×100〕,同居開始日から交尾確認日までの日数およびその間に回帰した発情期の回数を求めた.なお,腟スメア採取は,交尾確認日まで継続して行った.

(5) 分娩・哺育状態

交尾した雌は,全例を自然分娩させた.分娩状態は直接観察が可能な動物について行い,分娩状態が直接観察できなかった動物については,分娩後の徴候から分娩障害の有無を判断して記録した.分娩の確認は,午前9時〜11時に行い,分娩が完了した雌は,その日を分娩日(哺育0日)として妊娠期間(妊娠0日〜分娩日の日数)を算出した.分娩後は哺育状態を毎日観察した.

(6) 剖検・病理組織学検査

雄動物は,投与47日の翌日に,ペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血・致死させ,剖検した.その際,下垂体,甲状腺,精巣および精巣上体の重量を測定した.また,下垂体と甲状腺は0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に,精巣および精巣上体はブアン液に固定し,高用量群および対照群の全例について病理組織学検査を行なった.

雌動物のうち,交尾しなかった雌は投与54日の翌日に,交尾は確認されたが分娩しなかった雌は妊娠26日相当日に,分娩した雌は哺育4日にそれぞれペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血・致死させ,剖検した.その際,下垂体,卵巣および子宮を摘出して,卵巣については実体顕微鏡下で妊娠黄体数を数え,子宮については着床数を数え,着床率〔(着床数/黄体数)×100〕を算出した.下垂体,甲状腺および卵巣は0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に固定し,高用量群および対照群の全例について病理組織学検査を行なった.

2) 出生児

(1) 産児数および死亡児

哺育0日に産児数(生存児+死亡児)を調べ,分娩率〔(産児数/着床痕数)×100〕および生児出産率〔(出産生児数/着床痕数)×100〕を求めた.また,出産率〔(生児出産雌数/妊娠動物数)×100〕を算出した.生存児は外表を観察し,性別および外表奇形(矮小児を含む)の有無を検査した.哺育0日以降は死亡児数を毎日調べ,出生率〔(出産生児数/総産児数)×100〕および新生児生存率〔(哺育4日の生児数/哺育0日の生児数)×100〕を求めた.死亡児は剖検し,異常の認められた器官は10 %ホルマリン溶液に固定して保存した.

(2) 体重

哺育0および4日に個体別に測定し,各腹ごとに雌雄別の平均値を算出した.

(3) 剖検

出生児は哺育4日に剖検し,外表および内部器官の異常の有無を観察した.文献検索の結果,o-トルエンスルホンアミドを母動物に経口的に摂取させた場合,胎児の水晶体の空胞変性が認められるとする報告2)が有ることから,頭部は0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に固定し,対照群は1母動物あたり雌雄各1例,高用量群では1母動物あたり雌雄各4例について眼球の病理組織学検査を行った.

5. データ解析法

交尾率,受胎率および出生児の形態異常出現頻度についてはFisherの直接確率検定3)を行った.病理組織学所見では,グレード分けしたデータはMann-WhitneyのU検定3,4)により,また,陽性グレードの合計値はFisherの直接確率の片側検定により対照群とo-トルエンスルホンアミド投与群の間の有意差検定を行った.その他のデータは個体ごとに得られた値あるいは各腹ごとの平均値を1標本として,先ずBartlett法5)により各群の分散の一様性について検定を行った.分散が一様である場合には一元配置型の分散分析5)を行い,群間に有意性が認められる場合はDunnett法6)により多重比較を行った.一方,いずれかの群で分散が0となる場合および分散が一様でない場合にはKruskal-Wallisの順位検定7)を行い,群間に有意性が認められる場合にはDunnett型の検定法により多重比較を行った.有意水準は5 %とした.

結果

1. 反復投与毒性(親動物所見)

1) 死亡例,瀕死動物,一般状態

雌雄ともにいずれの投与群にも死亡あるいは瀕死動物は認められなかった.

雌雄ともに100 mg/kg投与群の全例において投与後一過性に活動性の低下が観察されたほか,流涎が雄の12例,雌の11例に観察された.活動性の低下および流涎は投与後4時間以内に回復した.その他の変化として脱毛が4 mg/kg投与群の雌2例および100 mg/kg投与群の雄1例に,紅涙が4および100 mg/kg投与群の雄で各1例に,赤色尿が20 mg/kg投与群の雄1例に観察された.

2) 体重,摂餌量(Table 1〜4)

雌雄ともに,20 mg/kg以下の投与群の体重推移には投与の影響は認められなかった.100 mg/kg投与群では体重増加が抑制され,雄では投与1〜8,1〜15,1〜22および43〜48日の体重増加量が,雌では投与15日の実測値および投与1〜15日の体重増加量が対照群と比較して有意(p<0.05,p<0.01)な低値を示した.

雄の摂餌量に投与の影響はみられなかった.雌では20 mg/kg投与群の妊娠20〜21日の摂餌量が有意(p<0.05)な低値を示したが,100 mg/kg投与群では有意差は認められないこと,分娩前の雌ではよくみられる変化であることから,投与とは関係の無い変化であると考えられた.

3) 剖検時検査所見

A. 雄

(1) 剖検所見

100 mg/kg投与群に異常は認められなかった.

精巣の小型化が対照群の1例,4 mg/kg投与群の2例に観察された.また,一般状態の変化として赤色尿が観察された20 mg/kg投与群の雄1例に腎盂拡張が観察された.

(2) 器官重量(Table 5)

下垂体,甲状腺および精巣については,いずれの投与群も重量および比体重値ともに,対照群との間に有意差は認められなかった.精巣上体では,4 mg/kg投与群の重量および比体重値,100 mg/kg投与群の重量が対照群と比較して有意(p<0.05,p<0.01)に減少したが,20 mg/kg投与群と対照群の間に差は認められなかった.

(3) 病理組織検査所見(Table 6)

精巣および精巣上体では,精細管の萎縮が対照群の3例,4 mg/kg投与群の2例および100 mg/kg投与群の3例に認められた.これらの例では,精細管内の生殖細胞の減少,ライディッヒ細胞のびまん性の過形成,多核巨細胞,精巣上体管内の細胞残屑と精子数の減少が認められたが,いずれの所見も対照群と各投与群との間で発現頻度,程度とも差は認められなかった.この他に,100 mg/kg投与群の2例の下垂体にラトケ嚢の嚢胞が,対照群と100 mg/kg投与群の各1例の甲状腺に異所性の胸腺組織が認められた.また,剖検時に腎盂拡張が観察された20 mg/kg投与群の雄1例では,腎臓の髄質に硝子円柱が認められた.

B. 雌

(1) 剖検所見

4 mg/kg投与群の不妊例の1匹に子宮および腟内腔の拡張が,未分娩例の1匹に脾臓の暗色化,白色域の存在,被膜の白濁,表面粗造および濾胞の明瞭化が認められ,胃,肝臓および膵臓と癒着していた.また,肝臓の淡色化をともなう腫大,副腎,下顎リンパ節,縦隔リンパ節および腸間膜リンパ節の腫大,子宮内腔の拡張が認められた.

(2) 病理組織検査所見(Table 7)

100 mg/kg投与群において,卵巣に黄体嚢胞が1例,下垂体にラトケ嚢の拡張が1例認められた他,対照群の2例および100 mg/kg投与群の1例の甲状腺に異所性の胸腺組織が認められたが,いずれも程度は軽く発現頻度に差はみられなかったこと,使用した系統のラットでは,無処置の動物においてもみられる変化であることから,投与とは関係の無い変化であると考えられた.

剖検時に4 mg/kg投与群の1例において脾臓と周囲組織の癒着が観察され,病理組織検査では脾臓に限局性の壊死および好中球の浸潤が認められ,癒着部位にはリンパ球,好中球,褐色色素を含んだマクロファージの浸潤がみられたほか,脾臓の壊死領域および癒着部位の一部に線維化も認められた.その他,脾臓には髄外造血および褐色色素の沈着も中等度に観察された.また,同例の肝臓には類洞内にクッパー細胞の増殖が認められたほか,下顎,縦隔,腸間膜リンパ節の髄洞にマクロファージ,髄索に形質細胞の増殖,肺には泡沫細胞の集簇がみられた.また,剖検時に,子宮および腟に内腔の拡張が観察された4 mg/kg投与群の1匹では子宮の粘膜上皮には細胞残屑を伴う空胞化や多数の好中球の浸潤が認められたほか,腟は嚢胞状に拡張し,粘膜上皮および粘膜固有層には好中球およびリンパ球の浸潤がみられた.しかし,類似した変化は他の投与群では観察されていないことから,投与とは関係の無い変化であると考えられた.

2. 生殖発生毒性

1) 性周期および交配成績(Table 8)

投与開始から交配まで,および同居開始から交尾までに要した日数ならびにその間に回帰した発情期の回数に,対照群と各投与群との間で有意差は認められなかった.また,交尾率および受胎率には投与の影響はみられなかった.なお,交尾が確認されなかった4 mg/kg投与群の1匹は剖検時に着床痕が確認されたが,交尾した時期を特定することは出来なかった.

2) 分娩および哺育状態

観察が可能であった動物については分娩状態の異常は観察されなかった.また,哺育状態の異常は認められなかった.

3) 出産率および妊娠期間

出産率および妊娠期間に対照群と各投与群との間で有意差は認められなかった.

4) 妊娠黄体数,着床数および着床率

黄体数,着床数および着床率に対照群と各投与群との間で有意差は認められなかった.

3. 産児所見

1) 一般状態および生存性(Table 9)

いずれの群の産児にも一般状態の異常は観察されなかった.

児の生存性についても分娩率,生児出産率,出生率,性比および哺育4日の新生児生存率には,対照群と各投与群との間に有意差は認められなかった.

2) 体重(Table 10)

雌雄ともにいずれの投与群も,対照群と同様に推移した.

3) 形態

100 mg/kg投与群において矮小児,尾端の切断および左後肢の血腫がそれぞれ1例みられたが,矮小児は哺育4日まで生存し,剖検においても異常は認められなかった.また,尾端の切断および左後肢の血腫の児では,いずれも母動物によると考えられる咬傷が認められた.この他に,4 mg/kg投与群の1例に頚部の皮下出血が認められたが,ラットの新生児ではよく観られる変化であること,20 mg/kg以上の投与群では同様の変化は観察されていないことから,いずれも投与とは無関係であると判断した.この他の生存産児に異常は認められなかった.

哺育4日の剖検において異常は認められなかった.死亡児の剖検においても異常はみられなかった.また,対照群および100 mg/kg投与群の哺育4日の生存児について行った眼球の病理組織検査でも異常は認められなかった.

考察

雌雄ともに一般症状の変化として,100 mg/kg投与群において投与後に活動性の低下と流涎が観察され,体重増加も抑制された.これらの変化は,先におこなわれた併合試験1)の100 mg/kg以上の投与群においても観察されていることからo-トルエンスルホンアミドの投与に起因した変化と考えられた.

剖検および病理組織学検査では,対照群ならびに低用量群の雄において少数例で精巣の小型化が認められ,病理組織学的検査の結果,精細管の萎縮,精巣上体管内腔の細胞残屑の存在,ライディッヒ細胞のびまん性の過形成と精細管内の生殖細胞の減少が認められたが,その発現頻度および程度に差はみられず,精巣上体重量が低下したものの精巣重量には差は認められず,対照群にも認められる変化であること,先におこなわれた併合試験1)では,500 mg/kgまでの投与によっても精巣上体重量の低下は認められていないことから,被験物質の投与とは関係の無い変化であると考えられた.

雌の性周期,雌雄の交尾,受胎能,妊娠期間および出生児の生存性ならびに体重には,投与による影響を示唆する変化は認められなかった.

また,対照群と100 mg/kg投与群の出生児についておこなった眼球の病理検査においても異常は認められなかった.

これらのことから本試験条件下では,o-トルエンスルホンアミドの親動物に対する無影響量は20 mg/kg/day,親動物の生殖能力および出生児に対する無影響量は100 mg/kg/dayと考えられた.

文献

1)代田眞理子,化学物質毒性試験報告書,7, 134-152 (1999).
2)J. Lederer, Louvain M仕., 96, 495-501(1977).
3)石居進,"生物統計学入門,"培風館,東京,1992.
4)丹後俊郎,"医学への統計学,"朝倉書店,東京,1985.
5)佐久間昭,"薬効評価−計画と解析,"東京大学出版会,東京,1977.
6)C. W. Dunnett, Biometrics, 20, 482-491(1964).
7)W. H. Kruskal, W. A. Wallis, J. Amer. Statist. Assoc. 47, 583-621(1952).

連絡先
試験責任者:高島宏昌
試験担当者:渡辺千朗,内藤由紀子,丸茂秀樹,堀内伸二,稲田浩子,三枝克彦,安生孝子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Hiromasa Takashima(Study director)
Chiaki Watanabe, Yukiko Naito, Hideki Marumo, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257-8523, Japan
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