2-エチルアントラキノンのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 2-Ethylanthraquinone in Rats

要約

2-エチルアントラキノンの28日間反復経口投与毒性試験(回復14日間)を雌雄のSprague-Dawley系ラットを用いて実施した.投与量は雌雄とも0(対照群),10,50および250 mg/kgとし,0および250 mg/kg投与群は回復試験の動物を含む1群10匹,10および50 mg/kg投与群は1群5匹を使用して試験を行った.

その結果,いずれの投与群においても死亡例は認められなかった.一般状態の変化として,250 mg/kg投与群では,雌雄とも投与第1日から潜血反応陰性の赤色尿の排泄がみられ,投与第4日以降,回復第1日までは,ほぼ全例に連日観察された.また,50 mg/kg投与群でも,投与中期を中心に赤色尿の排泄が認められた.50 mg/kg以上の投与群の雄および250 mg/kg投与群の雌では,投与初期の摂餌量が低値を示したが,体重に差は認められなかった.また,尿検査所見として,投与第4週の検査では,250 mg/kg投与群において,尿の褐色化のほか,雌1例では,尿沈渣中に無色の針状結晶が認められた.血液学検査では,50 mg/kg投与群の雄および250 mg/kg投与群の雌雄に,赤血球数およびヘマトクリット値の減少がみられ,赤血球数の減少は10 mg/kg投与群の雄でも認められたほか,50 mg/kg以上の投与群の雄では平均赤血球血色素濃度の上昇,250 mg/kg投与群の雌雄では網状赤血球比率の増加が認められた.また,250 mg/kg投与群の雄では,血液凝固時間の延長が認められた.血液生化学検査では,250 mg/kg投与群において,アルブミン濃度の上昇が雌雄に,総蛋白,総コレステロール,トリグリセライドおよび総ビリルビン濃度の上昇が雌にみられ,雄ではトリグリセライド濃度の低下が認められた.また,総ビリルビン濃度の上昇は,50 mg/kg投与群の雌でも認められた.器官重量では,250 mg/kg投与群の雌雄とも肝臓重量が増加したほか,雌では脾臓,雄では腎臓重量の増加が認められた.投与期間終了時の主な剖検所見として,250 mg/kg投与群では,肝臓の大型化と暗色化が観察された.病理組織学検査では,肝臓の小葉中心性の肝細胞肥大が50 mg/kg以上の投与群に認められ,その変化の程度は雌雄とも用量に依存して増強する傾向にあった.また,250 mg/kg投与群では,肝細胞核の大小不同が認められた.一方,通常みられる肝臓の門脈周囲性の脂肪化は,250 mg/kg投与群では認められなかった.脾臓では,250 mg/kg投与群において,ヘモジデリン沈着および髄外造血が,それぞれ対照群と比較して増強する傾向にあった.

回復試験では,上記の所見の多くが消失あるいは軽減したが,雄の血色素量およびヘマトクリット値の減少,網状赤血球比率の増加,プロトロンビン時間の延長および雌雄の肝臓相対重量の増加に有意な差が認められたほか,脾臓のヘモジデリン沈着は雌雄で,また髄外造血は雄で,それぞれ程度が強い傾向にあった.

以上のことから,本試験条件下における2-エチルアントラキノンの無影響量は,雄では10 mg/kg/day未満,雌では10 mg/kg/dayであると判断された.

方法

1. 被験物質

被験物質として,山本化成(株)(福岡)より提供された2-エチルアントラキノン(ロット番号:98-11056,純度:99.16 %)を用いた.提供された被験物質は,不純物としてアントラキノン0.01 %,硫黄分1.4 ppm,塩素分14.3 ppmを含有していた.被験物質は,使用時まで室温で保管した.なお,被験物質の試験期間中の安定性は,残余被験物質を提供元で再分析することにより確認した.

投与検体の媒体として,0.1 %ポリソルベート80添加0.5 % CMC Na水溶液を用いた.媒体は,0.5 w/v%となるように秤量したCMC Na(カルメロースナトリウム,製造番号:6Z09,丸石製薬(株))を注射用水(日局注射用水,製造番号:9707SA,光製薬(株))に溶解し,これに0.1 w/v%の割合でポリソルベート80(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート,ロット番号:TPN3571,和光純薬工業(株))を加えて調製した.

投与検体は,用量ごとに被験物質を秤量し,所定濃度となるように媒体を加えて懸濁して調製した.なお,初回に調製した各濃度の投与検体について含量測定および均一性試験を実施した結果,懸濁液中の被験物質の平均含量は,所定濃度の92.3〜102 %であり,均一性についても問題はなかった.また,動物試験に先立ち,被験物質の0.2および20 w/v%懸濁液の安定性を調べたところ,冷蔵,遮光条件下で8日間は安定であることが確認されたため,投与検体の調製は,1週に1回の頻度で調製し,冷蔵,遮光下で保管した.

2. 動物および飼育方法

試験には,生後4週で購入し,検疫を兼ねて9日間予備飼育した雌雄のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD(SD)IGS,日本チャールス・リバー(株))各30匹を使用した.

群分けは,検疫期間中に異常がなかった動物を用い,投与開始前日の体重に基づいて体重別層化無作為抽出法により行った.動物数は,雌雄とも対照群および高用量群を各10匹とし,低および中用量群を各5匹とした.

動物は,温度24 ± 1 ℃,湿度50〜65 %,換気回数約15回/時,照明12時間(7〜19時点灯)に設定した飼育室内で,金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し,固型飼料(CE-2,日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水)を自由摂取させて飼育した.

3. 投与量の設定および投与方法

本試験の投与量は,投与量設定のための予備試験の結果に基づき決定した.すなわち,雌雄のラットに2-エチルアントラキノンを0,250,500および1000 mg/kgの用量で,7日間反復投与することにより,250 mg/kg以上の投与群で,投与初期に体重の増加抑制があり,1000 mg/kg投与群では,投与第5日以降,被毛の汚れ,軟便,立毛,削痩および排便量の減少などの症状が観察された.また,500 mg/kg以上の投与群では赤色尿がみられたほか,250 mg/kg以上の投与群では,尿沈渣中に針状結晶が認められた.さらに,剖検所見では,250 mg/kg以上の投与群で肝臓の肥大ないし暗色調を示す例が散見され,1000 mg/kg投与群では胃粘膜に肥厚あるいは暗色点がみられる例もあった.以上のことから,本試験では投与期間を考慮し,高用量を250 mg/kgとし,以下公比5で除して50および10 mg/kgを中用量および低用量とした.また,雌雄とも媒体である0.1 %ポリソルベート80添加0.5 % CMC Na水溶液を投与する対照群を設けた.

投与経路は強制経口投与とし,1日1回,28日間,ラット用胃管を用いて投与した.投与容量は5 mL/kgとし,投与液量は雌雄とも最近時の体重をもとに個体別に算出した.なお,回復期間は14日間とした.

4. 観察および検査

1) 一般検査

毎日(投与期間中は投与前および投与後)全例の一般状態を観察した.また,体重は,投与第1週の第1日の投与直前と4日,投与第2週以降回復期間終了週までは1週に2回の頻度で測定し,その他,投与期間終了日,回復期間終了日および剖検日にも測定した.摂餌量は,投与第1週では,投与第1日から2日にかけて1日あたりの摂餌量を測定し,以後回復期間終了週まで毎週1回の頻度で測定した.

2) 尿検査

各群とも全例について,投与第4週および回復第2週に代謝ケージに収容して蓄尿し,約4時間の時点で採尿した.この4時間尿を用いて,色調,濁度(視診)およびpH(pH BOY-P2,新電元工業(株))を検査し,また,試験紙法(クリニテック200+,バイエル・三共(株))により潜血を,さらに,光学顕微鏡により沈渣を検査した.

3) 血液学検査

投与期間ないし回復期間終了日から翌日の剖検日にかけて定期解剖例全例を18から24時間絶食させ,ペントバルビタールナトリウム麻酔下で腹部後大静脈よりEDTA 2Kを抗凝固剤として採血し,Coulter Counter Model S-PLUS(コールターエレクトロニクス(株))により赤血球数,白血球数,平均赤血球容積,血小板数(以上,電気抵抗法)および血色素量(吸光度法)を測定し,これらを基にヘマトクリット値,平均赤血球血色素量および平均赤血球血色素濃度を算出した.血液の一部は塗抹標本とし,白血球分類(Wright-Giemsa染色)および網状赤血球比率(Brecher法)を求めた.また,クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採取した血液をCA-1000(東亜医用電子(株))によりプロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間(光散乱検出法)を測定した.

4) 血液生化学検査

血液学検査用の採血に引き続き,ヘパリンを抗凝固剤として採血し,血漿を分離して遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA,ロシュ・ダイアグノスティックス(株))により,総蛋白濃度(ビウレット法),アルブミン濃度(BCG法),総コレステロール濃度(COD・DAOS法),ブドウ糖濃度(グルコキナーゼ・G6PDH法),尿素窒素濃度(ウレアーゼ・Gl.DH法),クレアチニン濃度(クレアチナーゼ・F-DAOS法),アルカリフォスファターゼ活性(GSCC法),GOT活性(IFCC法),GPT活性(IFCC法),γ-GTP活性(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法),トリグリセライド濃度(GPO・DAOS法),無機リン濃度(モリブデン酸直接法),総ビリルビン濃度(Jendrassik/Grof法),カルシウム濃度(OCPC法),を測定し,A/G比を算出した.また,全自動電解質分析装置(EA05,(株)A&T)により,ナトリウム濃度,カリウム濃度および塩素濃度(イオン電極法)を測定した.

5) 病理学検査

上記の採血に引き続き,動物を放血屠殺したのち,器官および組織の肉眼的観察を行った.また,各動物の脳,胸腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,卵巣または精巣,精巣上体の重量測定を行い,各器官重量を剖検日の体重で除して,それぞれの相対重量を算出した.さらに,脳,下垂体,脊髄,眼球,甲状腺,上皮小体,心臓,気管,気管支,肺,肝臓,腎臓,胸腺,脾臓,副腎,胃,十二指腸,空腸,回腸,盲腸,結腸,直腸,前立腺,精嚢,卵巣,子宮,腟,乳腺,膀胱,下顎リンパ節,腸間膜リンパ節,骨格筋(下腿部),坐骨神経,大腿骨骨髄,膵臓,顎下腺,舌下腺,舌,食道,大動脈,ハーダー腺,皮膚,病変部を0.1 mol/Lリン酸緩衝10 vol%ホルマリン溶液(pH 7.2)に固定し,精巣,精巣上体はブアン液に固定した.心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,胃,精巣,精巣上体,卵巣および病変部はパラフィン包埋後,ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し,先ず,対照群および高用量群について病理組織学検査を実施した.次いで,被験物質投与による影響が疑われた肝臓および脾臓について,全例の病理組織学検査を実施した.また,脾臓に褐色色素沈着がみられたため,全例のベルリンブルー染色標本を作製し,病理組織学検査を追加した.この他,肉眼的異常が認められた器官・組織についても病理組織学検査を実施した.

5. 統計解析

体重,摂餌量および定期解剖例の血液学検査,血液生化学検査ならびに器官重量について,群ごとに平均値および標準偏差を求めた.また,試験群が3群以上の場合は,Dunnett法で多重比較を行い,2群の場合には,Studentのt検定ないしAspin-Welchのt検定を行った.さらに,病理組織学検査所見は,グレード分けしたデータについてMann-WhitneyのU検定を,陽性グレードの合計値についてFisher直接確率の片側検定を行った.なお,これら対照群および被験物質投与群との間の有意差検定はいずれの場合も有意水準を5 %とした.

結果

1. 一般状態

250 mg/kg投与群では,雌雄とも投与第1日から赤色尿の排泄がみられ,投与第4日以降,回復第1日までは,ほぼ全例に連日観察された.また,50 mg/kg投与群の雄全例,雌3例でも,投与第11日から25日の間に1ないし5日の頻度で赤色尿の排泄が認められた.なお,投与期間および回復期間中に死亡例はなかった.

2. 体重(Fig. 1, 2)

観察期間中,被験物質投与群では,雌雄いずれにおいても対照群との間に体重の有意な差は認められなかった.

3. 摂餌量(Fig. 3)

50 mg/kg以上の投与群の雄では,投与第1週の摂餌量が対照群と比較して有意な低値を示し,また,250 mg/kg投与群の雌では,投与第1週および2週の摂餌量が有意な低値を示した.その後の投与期間および回復期間中にはいずれの被験物質投与群においても有意な差は認められなった.

4. 尿検査(Table 1)

投与第4週の尿検査では,雌雄とも対照群および10 mg/kg投与群の尿色調が淡黄色であったのに対して,50 mg/kg以上の投与群の多くの例の尿色調は,黄色から黄褐色であった.また,250 mg/kg投与群の雌1例では,尿沈渣中に通常みられるリン酸アンモニウムマグネシウム結晶のほかに,無色の針状結晶が少数認められた.この他,対照群の雄1例では,潜血反応が陽性で,尿沈渣中には赤血球が観察された.一方,回復第2週の検査では,被験物質投与群の雌1例の尿沈渣中に少量の赤血球が観察された以外,特記すべき所見はなかった.

5. 血液学検査(Table 2)

1) 投与期間終了時解剖例

10 mg/kg以上の投与群の雄および250 mg/kg投与群の雌では,赤血球数の有意な減少がみられ,これに伴って,250 mg/kg投与群の雌における血色素量の有意な減少,50 mg/kg以上の投与群の雄と250 mg/kg投与群の雌におけるヘマトクリット値の有意な減少,50 mg/kg以上の投与群の雄における平均赤血球血色素濃度の有意な上昇,250 mg/kg投与群の雌雄における網状赤血球比率の有意な増加が認められた.また,250 mg/kg投与群の雄では,プロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間の有意な延長が認められた.

2) 回復期間終了時解剖例

被験物質投与群の雄では,血色素量およびヘマトクリット値の有意な減少と網状赤血球比率の増加がみられたほか,プロトロンビン時間の有意な延長が認められた.また,雌では,白血球数の有意な増加が認められたが,その個体別の値は4200〜6900/mm3と生理的変動範囲内であった.

6. 血液生化学検査(Table 3)

1) 投与期間終了時解剖例

250 mg/kg投与群では,アルブミン濃度の有意な上昇が雌雄に,総蛋白,総コレステロール,トリグリセライド,総ビリルビンおよびカルシウム濃度の有意な上昇と塩素濃度の有意な低下が雌にみられ,雄ではトリグリセライド濃度の有意な低下が認められた.また,50 mg/kg投与群の雌でも総ビリルビンおよびカルシウム濃度の有意な上昇が認められた.この他,10 mg/kg投与群の雄では,総蛋白濃度の有意な低下が認められたが,用量に依存した変化ではなかった.

2) 回復期間終了時解剖例

被験物質投与群では,雌のA/G比が有意な低値を示したが,投与期間終了時にみられた項目には有意な差は認められなかった.

7. 病理学検査

1) 肉眼所見

(1) 投与期間終了時解剖例

肝臓では,大型化が250 mg/kg投与群の雌雄全例に,暗色化が250 mg/kg投与群の雄3例,雌4例に観察された.腎臓では,大型化が250 mg/kg投与群の雄1例に,腎盂の拡張が50 mg/kg投与群の雄1例に認められた.この他,胃では腺胃粘膜の黒色点が250 mg/kg投与群の雌1例に観察された.

(2) 回復期間終了時解剖例

250 mg/kg投与群の雄では,肝臓の大型化と腎盂の拡張が各1例に観察された.

2) 器官重量(Table 4)

(1) 投与期間終了時解剖例

250 mg/kg投与群では,雌雄とも肝臓の絶対および相対重量に有意な増加がみられたほか,雌では脾臓の絶対および相対重量に,また,雄では腎臓の相対重量に,いずれも有意な増加が認められた.

(2) 回復期間終了時解剖例

被験物質投与群では,雌雄とも肝臓の相対重量に有意な増加が認められた.

3) 病理組織学検査(Table 5)

(1) 投与期間終了時解剖例

肝臓では,小葉中心性の肝細胞肥大が250 mg/kg投与群の雌雄全例,50 mg/kg投与群の雄全例,雌3例に観察され,その変化の程度は雌雄とも用量に依存して増強する傾向にあった.また,250 mg/kg投与群では,肝細胞核の大小不同が認められた.さらに,通常の飼育条件で対照群に観察される肝臓の門脈周囲性の脂肪化は,250 mg/kg投与群の雌雄ともに認められなかった.脾臓では,ヘモジデリン沈着および髄外造血が250 mg/kg投与群の雌雄とも,それぞれ対照群と比較して有意な増強あるいは増強傾向がみられ,250 mg/kg投与群の雄2例,雌全例,50 mg/kg投与群の雌1例ではうっ血が認められた.この他,自然発生性の所見が観察されたが,いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められなかった.なお,肉眼的に病変がみられた部位の所見として,腎盂の拡張がみられた50 mg/kg投与群の雄1例の腎臓では,組織学的にも腎盂の拡張が観察されたが,腺胃粘膜の黒色点がみられた250 mg/kg投与群の雌1例の胃では,これに対応すると考えられる組織学的変化は認められなかった.

(2) 回復期間終了時解剖例

肝臓では,軽微あるいは軽度な小葉中心性の肝細胞肥大が,被験物質投与群の雄2例に観察された.脾臓では,被験物質投与群の雄におけるヘモジデリン沈着および髄外造血の程度が増強し,雌においても中程度のヘモジデリン沈着が4例で,対照群と比較してその変化の程度は強い傾向が認められた.さらに,うっ血が被験物質投与群の雄全例,雌3例に観察された.

考察

2-エチルアントラキノンを,10,50および250 mg/kgの用量で雌雄のSprague-Dawley系ラットに28日間にわたって強制経口投与し,その後14日間の回復期間を設けた.

その結果,主として赤血球系および肝臓で被験物質投与に起因したと考えられる変化が生じた.すなわち,雄では10 mg/kg以上の投与群,雌では250 mg/kg投与群で赤血球数の減少がみられ,関連する所見として,高用量群を中心に,ヘマトクリット値の減少,平均赤血球血色素濃度および網状赤血球比率の増加,血漿中総ビリルビン濃度の上昇,脾臓の重量増加とヘモジデリン沈着および髄外造血の増強ならびに血管拡張が認められた.アントラキノン類の一種である1-アミノ-2,4-ジブロモアントラキノンのラットおよびマウスにおける13週間混餌投与毒性試験1),ならびに1-アミノアントラキノンのラットを用いた反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験2)においても貧血がみられ,その所見から溶血性貧血の可能性が示唆されており,今回の試験でみられた所見からも,赤血球数の減少は溶血によるものと考えられる.一方,回復期間終了時には,投与期間終了時にみられた赤血球系の変化は軽減したことから,今回認められた溶血性貧血は,投与中止により回復傾向を示すものと考えられる.

高用量群を中心に赤色尿の排泄と一部の尿沈渣中に無色の針状結晶がみられたが,同様の変化は,本試験の予備試験でも認められた.すなわち,1000 mg/kgの用量を投与して採取した尿および血漿は赤色調を呈し,血漿の吸収スペクトルを調べたところ,326,410,509 nmに被験物質に起因すると考えられる吸収がみられ,尿沈渣には多量の針状結晶が認められた.1-アミノアントラキノンを投与すると赤色調の尿が排泄され2),また,1-メチルアミノアントラキノンの投与ではグルクロン酸抱合された着色した代謝物が尿中に排泄されることがそれぞれ報告されている3).前述のように,今回の試験結果から,2-エチルアントラキノン投与により溶血が疑われるが,尿の潜血反応はいずれも陰性であったことから赤色尿は被験物質に由来するものと考えられる.また,尿沈渣中の針状結晶の詳細は不明であるが,予備試験でみられた結晶の形態と同様であることから,これも被験物質に由来するものと考えられる.なお,尿の色調は尿検査時と一般状態観察時とで,黄褐色と赤色というように異なるが,これは投与後の時間経過によりその色調が変化したことによる相違と考えられる.

肝臓に関する所見として,肝臓の小葉中心性の肝細胞肥大が50 mg/kg以上の投与群にみられ,その程度の強い例では,肝細胞核の大小不同が認められた.類似する所見は,前述した1-アミノ-2,4-ジブロモアントラキノンの13週間混餌投与毒性試験でも観察されている.この他,通常みられる肝臓の門脈周囲性の脂肪化が250 mg/kg投与群では認められず,関連する所見として,高用量群を中心に,アルブミン濃度の上昇が雌雄,総コレステロール,トリグリセライド濃度の上昇が雌にみられ,雄ではトリグリセライド濃度の低下が認められたが,その毒性学的意味は不明であった.また,250 mg/kg投与群の雄では,血液凝固時間の延長がみられたことから,肝臓での血液凝固因子の生成が障害された可能性も考えられるが,著しい形態的変化は認められなかったことから,その詳細は不明である.回復期間終了時には,肝臓の変化はいずれも軽減する傾向にあり,被験物質投与群の雌では,グロブリン濃度の上昇に伴うと考えられるA/G比の減少が認められた.

その他,被験物質投与によると考えられる変化として,投与初期の摂餌量が用量依存的に低値を示したが,観察期間中の体重には対照群と被験物質投与群との間に差はなく,その影響は軽微なものであった.また,投与期間終了時に,高用量群の雄で腎臓重量の増加がみられたが,組織学検査では関連する変化は認められず,重量増加の成因は,本試験では明らかにすることはできなかった.さらに,雌で用量依存的な血漿中カルシウム濃度の上昇と塩素濃度の低下がみられたが,その毒性学的意味は不明であった.

以上のように,2-エチルアントラキノンを反復投与することにより,溶血性貧血と考えられる赤血球数の減少が雄では10 mg/kg以上,雌では250 mg/kgの用量で認められた.また,肝臓の小葉中心性の肝細胞肥大が雌雄とも50 mg/kg以上の用量でみられ,その程度の強い例では肝細胞核の大小不同が認められ,2-エチルアントラキノン投与による肝臓への影響が示唆された.これらのことから,本試験条件下における2-エチルアントラキノンの無影響量は雄では10 mg/kg/day未満,雌では10 mg/kg/dayであると判断された.

文献

1)R. W. Fleischman, H. J. Esber, M. Hagopian, H. S. Lilja, J. Huff, Toxicology and Applied Pharmacology, 82, 389 (1986).
2)長尾哲二,代田眞理子,森村智美,田子和美,化学物質毒性試験報告, 3, 87(1996).
3)B. W. Martin, G. W. Ivie, E. M. Bailey, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 12, 499(1983).

連絡先
試験責任者:畔上二郎
試験担当者:森村智美,加藤博康,関 剛幸,古谷真美,永田伴子,吉村愼介,堀内伸二,稲田浩子,三枝克彦,安生孝子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Jiro Azegami(Study Director) Tomomi Morimura, Hiroyasu Katoh, Takayuki Seki, Mami Furuya, Tomoko Nagata, Shinsuke Yoshimura, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627