栄研 7，栄研化学(株))に尿を滴下後に尿自動分析装置(US-2100，栄研化学(株))を用いて検査した．尿沈渣は，沈渣を尿沈渣染色液で染色後に顕微鏡下で観察した．なお，採尿は，当日の検体投与後に行った．
1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-1,3,5-トリアジン-2,4,6-(1H,3H,5H)-トリオンのラットを用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験を行い，雌雄動物に対する毒性影響を検討するとともに，雌雄親動物の生殖能力および児動物の発生・発育に及ぼす影響について検討した．投与量は，1000 mg/kgを最高用量とし，以下300，100および30 mg/kgとした．対照として媒体(注射用水)投与群を設けた．各群の使用動物数は雌雄各12例とした．
雌においては，いずれの群とも死亡および瀕死例は認められなかった．一般状態，体重，摂餌量，剖検所見および器官重量では，投与による変化はみられなかった．病理組織学検査では，1000 mg/kg群で肝臓に髄外造血がみられた．
発情回数，交尾率，交尾所要日数，受胎雌数，妊娠期間，分娩状態，哺育状態，受胎率，妊娠黄体数，着床数，着床率および出産率では，投与による変化はみられなかった．
総出産児数，死産児数，哺育0日の新生児数，性比，分娩率，児の産出率，出生率，哺育4日の生存児数，新生児の4日の生存率，新生児の外表，一般状態，体重および剖検所見では，投与による変化はみられなかった．
以上のように，1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-1,3,5-トリアジン-2,4,6-(1H,3H,5H)-トリオンの一般毒性学的無影響量は，雄では1000 mg/kg投与しても毒性学的影響が認められなかったことから1000 mg/kg/dayと考えられる．また，雌では1000 mg/kg投与により肝臓に髄外造血が認められたことから300 mg/kg/dayと考えられる．生殖発生毒性学的な無影響量は，1000 mg/kg投与しても雌雄親動物，児動物とも影響は認められなかったことからいずれも1000 mg/kg/dayと考えられる．
被験物質は，注射用水で溶解して調製した．調製に際して，被験物質の純度による換算は実施しなかった．なお，調製液は，室温・遮光条件下で7日間保存しても安定性に問題のないことが確認されていたため，各濃度の調製液は調製後，室温・遮光条件下で保管し，調製後7日以内に使用した．投与開始日に使用した投与液中の被験物質濃度を測定した結果，被験物質濃度に問題はなかった．
動物は，室温20〜26 ℃，湿度40〜70 %，明暗各12時間(照明:午前6時〜午後6時)，換気回数12回/時に維持されている飼育室で飼育した．検疫・馴化期間中はステンレス製ケージを用いて1ケージ当たり5匹までの雌雄別群飼育とし，群分け後はステンレス製ケージを用いて個別飼育した．母動物は，妊娠18日以降オートクレーブ処理した床敷(サンフレーク，日本チャールス・リバー(株))を入れたプラスチック製ケージで個別飼育し，自然分娩および哺育させた．飼料は固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))を自由に摂取させた．ただし，雄は剖検前日の午後4時頃から絶食した．飲料水は水道水を自由に摂取させた．
投与開始日の週齢は雌雄とも10週齢であり，体重範囲は雄が335〜364 g，雌が233〜263 gであった． 投与量は，雄ラットを用いた2週間経口投与による予備試験1) (投与段階:0，125，250，500および1000 mg/kg)の結果により決定した．すなわち，死亡はいずれの群にも認められず，一般状態，体重，摂餌量および剖検にも異常はみられなかった．そこで，当試験では，1000 mg/kgを最高用量とし，以下公比約3により300，100および30 mg/kgとした．また，対照として媒体(注射用水)のみを同容量投与する群を設けた．1群の動物数は，雌雄それぞれ12例とした．
投与期間は，雄では交配前14日間とその後35日間の合計49日間とし，雌では交配前14日間，交配期間中(最長14日間)，妊娠期間中および哺育3日までの合計40〜46日間とした．なお，投与開始日を投与1日とした．
3時間尿:色調は，外観判定とした．pH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンは，尿検査試験紙(ウロペーパー 栄研 7，栄研化学(株))に尿を滴下後に尿自動分析装置(US-2100，栄研化学(株))を用いて検査した．尿沈渣は，沈渣を尿沈渣染色液で染色後に顕微鏡下で観察した．なお，採尿は，当日の検体投与後に行った．
21時間尿:比重を屈折率により屈折型尿比重計(ユリペット-D，(株)ニコン)を用いて測定した．
24時間尿:尿量を比重と重量から算出した．
赤血球数(RBC)，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，血小板数および白血球数(WBC)は，EDTA-2K処理した血液について，多項目自動血球計数装置(Sysmex K-4500，シスメックス(株))を用いて測定した．さらに，平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．
網状赤血球比率は，EDTA-2K処理した血液をBrecher法により超生体染色してスライドガラスに塗抹後，Giemsa染色標本を作製して顕微鏡下で赤血球1000個中の網状赤球数を計数した．
白血球百分率は，EDTA-2K処理した血液をスライドグラスに塗抹し，May-Giemsa染色標本を作製して顕微鏡下で白血球100個を分類計数した．
プロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびフィブリノーゲン濃度は，3.13 %クエン酸ナトリウムで処理後，遠心分離(約4 ℃，3000 rpm，15分間)して得た血漿について，散乱光検出方式により血液凝固分析装置(コアグマスター，三共(株))を用いて測定した．
ASTはMDH-UV法，ALTはLDH-UV法，ALPはρ-ニトロフェニルリン酸基質法，γ-GTPはL-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法，総蛋白はBiuret法，総ビリルビンは安定化ジアゾニウム塩法，尿素窒素はウレアーゼ・GlDH法，クレアチニンはクレアチニナーゼ・F-DAOS法，ブドウ糖はヘキソキナーゼ・G-6-PDH法，総コレステロールはCOD・HDAOS法，トリグリセライドはGPO・HDAOS法，Caはο-CPC法，無機リンはPNP・XDH法，Na，KおよびClはイオン選択電極法により，いずれも生化学自動分析装置(AU 400，オリンパス光学工業(株))を用いて測定した．
アルブミン量は総蛋白量および蛋白分画値[電気泳動法，自動電気泳動装置(AES 310，オリンパス光学工業(株))]から，A/G(アルブミン/グロブリン)は蛋白分画値から算出した．
交尾確認は毎朝ほぼ一定時刻に行い，腟垢内に精子または腟栓を確認した雌を交尾成立動物として，その日を妊娠0日として起算した．
体重，摂餌量，尿量，尿比重，血液学検査，血液生化学検査，器官の絶対重量および相対重量，発情回数，交尾所要日数，妊娠期間，妊娠黄体数，着床数，着床率，総出産児数，死産児数，新生児数，分娩率，児の産出率，出生率，哺育4日の生存児数，新生児の4日の生存率，性比および外表異常の出現率は，各群で平均値および標準偏差を算出した．その後，Bartlett法による等分散性の検定を行い，等分散の場合には一元配置法による分散分析を行い，有意ならばDunnett法により行った．一方，等分散と認められなかった場合は，順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallisの検定)を行い，有意ならば順位を利用したDunnett型の検定法により行った．
交尾率，受胎率および出産率は，x2検定により行った．
なお，病理組織学検査において，1000 mg/kg群で毒性学的影響が示唆され他の用量群についても検査を実施した雌における肝臓の髄外造血については，対照群との群間比較を上記の順位を利用したDunnett型の検定法を用いて行った．
一般状態観察において，いずれの群とも異常はみられなかった．
色調，pH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンおよび沈渣は，各投与群とも対照群とほぼ同程度であった．
その他には，心臓において組織球浸潤が，肺において出血が，肝臓において限局性の肝細胞壊死および微小肉芽腫が，腎臓において尿細管上皮硝子滴出現が，前立腺においてリンパ様細胞浸潤が，ハーダー腺においてリンパ様細胞浸潤がみられたが，これらの変化はいずれも偶発的変化と判断される．
一般状態観察において，いずれの群とも異常はみられなかった．
哺育期間中において，30，100および300 mg/kg群では対照群と比べて摂餌量に有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて哺育4日に摂餌量の有意な高値がみられた．
器官重量において，各投与群とも対照群と比べていずれの絶対および相対重量にも有意差はみられなかった．
その他には，肝臓において肝細胞広範壊死，限局性の肝細胞壊死および微小肉芽腫が，脾臓において髄外造血が，腎臓において尿細管空胞化およびリンパ様細胞浸潤が，膀胱において潰瘍，粘膜固有層における出血および粘膜固有層におけるリンパ様細胞浸潤がみられたが，これらの変化は対照群でも通常観察される変化であること，あるいは対照群でのみ認められている変化であること，もしくはそれらの程度は対照群と比べて差がないことから，偶発的変化と判断される．
交尾所要日数は，各投与群とも対照群との間に有意差はみられなかった．
未交尾の組み合わせは対照群で1組みられたのみで，交尾率には各投与群と対照群との間に有意差はみられなかった．
不受胎雌は30 mg/kg群で1例みられたが，受胎率には各投与群と対照群との間に有意差はみられなかった．
各投与群とも，対照群と比べて妊娠黄体数，着床数および着床率に有意差はみられなかった．
出産率は，いずれの群とも100 %であった．哺育状態において，いずれの群とも異常はみられなかった．
新生児の外表観察では，いずれの群とも異常はみられなかった．死産児においては，300 mg/kg群で象鼻症が1例みられたが，その他の投与群においては認められなかったことから，偶発例と考えられる．
児動物の一般状態では，いずれの群とも異常はみられなかった．
雄に関しては，死亡および瀕死例はいずれの群にも認められなかった．また，観察期間を通して一般状態，体重および摂餌量に投与による影響はみられなかった．投与期間終了時の尿検査，血液学検査および血液生化学検査においても，投与による影響は認められなかった．また，剖検所見，器官重量および病理組織学的検査にも投与による影響は認められなかった．
雌に関しては，死亡および瀕死例はいずれの群にも認められなかった．また，観察期間を通して一般状態および体重に投与による影響はみられなかった．なお，1000 mg/kg群で哺育期に摂餌量の一過性の高値がみられたが，体重推移に異常の認められない変化であり，1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-1,3,5-トリアジン-2,4,6-(1H,3H,5H)-トリオンによる影響とは考えられない．また，剖検所見および器官重量にも投与による影響は認められなかった．病理組織学検査において，1000 mg/kg群で肝臓に髄外造血が2例みられた．しかし，他の器官・組織に病理組織学変化は認められないこと，髄外造血は2例でごく軽度に認められているのみであることから，軽微な変化と考えられる．
親動物の生殖発生に対しては，前述したように1000 mg/kg群でも，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，子宮，腟および乳腺に病理組織学変化は認められなかった．また，発情回数，交尾率，交尾所要日数，受胎率，妊娠黄体数，着床数，着床率，出産率，妊娠期間，分娩状態および哺育状態では，投与に起因すると思われる変化はみられなかった．
児動物に対しては，総出産児数，死産児数，哺育0日の新生児数，性比，分娩率，児の産出率，出生率，哺育4日の生存児数および新生児の4日の生存率に投与に起因すると思われる変化はみられなかった．新生児の外表観察において，投与に起因する異常はみられなかった．児動物の体重では，各投与群とも対照群との間に差はみられなかった．児動物の剖検では，いずれの群とも異常はみられなかった．
以上のように，1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-1,3,5-トリアジン-2,4,6-(1H,3H,5H)-トリオンの一般毒性学的無影響量は，雄では1000 mg/kg投与しても毒性学的影響が認められなかったことから1000 mg/kg/dayと考えられる．また，雌では1000 mg/kg投与により肝臓に髄外造血が認められたことから300 mg/kg/dayと考えられる．生殖発生毒性学的な無影響量は，1000 mg/kg投与しても雌雄親動物，児動物とも影響は認められなかったことからいずれも1000 mg/kg/dayと考えられる．
| 1) | 古橋忠和ほか，未公刊． |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 古橋忠和 | ||
| 試験担当者： | 三輪芳久，長瀬孝彦，牧野浩平，内藤一嘉，木村 均，岡田雅昭 | ||
| (株)日本バイオリサーチセンター羽島研究所 | |||
| 〒501-6251 岐阜県羽島市福寿町間島6-104 | |||
| Tel 058-392-6222 | Fax 058-392-1284 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Tadakazu Furuhashi(Study director) Yosihisa Miwa, Takahiko Nagase, Kohei Makino, Kazuyoshi Naito, Hitoshi Kimura and Masaaki Okada | |||
| Nihon Bioresearch Inc. | ||||
| 6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan | ||||
| Tel +81-58-392-6222 | Fax +81-58-392-1284 | |||