二クロム酸ナトリウム二水和物のチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる
染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of Chromic acid disodium sald dihydrate
in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

二クロム酸ナトリウム二水和物の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後18時間の回復時間)した場合，50 %の増殖抑制濃度はそれぞれ0.0083 mg/mLおよび0.18 mg/mLとなった．また，連続処理(24時間処理)した場合は0.0011 mg/mLとなった．このことから染色体異常試験の処理濃度は，短時間処理(6時間)のS9 mix非存在下およびS9 mix存在下における短時間処理では，0.018 mg/mL および0.18 mg/mLを最高処理濃度とし，公比2で各5濃度を設定した．本試験での毒性が強かったため，2回目の処理ではS9 mix非存在下では0.0090 mg/mLを最高濃度に，S9 mix存在下では0.090 mg/mLを最高濃度に公比2で各5濃度を設定した．

S9 mix非存在下における染色体分析は0.00056〜0.0023 mg/mL，S9 mix存在下における染色体分析は0.0056〜0.023 mg/mLで行った．その結果，S9 mix 非存在下では，すべての群で染色体異常が誘発された(11.5〜40.5 %，gapを除く)．S9 mix存在下では，0.011 mg/mLおよび0.023 mg/mLにおいて染色体異常が誘発された(9.5 %および50.5 %，gapを除く)．

以上の結果より，本試験条件下で二クロム酸ナトリウム二水和物は，染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　細胞

CHL/IU細胞はチャイニーズ・ハムスター，肺由来で，リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21代)した．解凍後は継代10代以内で試験に用いた．仔牛血清(CS，Cansera International Inc.)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬(株))培養液を用い，CO2インキュベーター(37 ℃，5 % CO2)内で培養した．

2.　S9 mix

S9(キッコーマン(株))は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．S9 mixは処理培地に10 vol%添加し，各成分の最終濃度はS9 5 vol%，グルコース6リン酸(Sigma Chemical Co.)0.83 mmol/L，b-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(オリエンタル酵母工業(株))0.67 mmol/L，MgCl2 0.83 mmol/L，KCl 5.5 mmol/L，HEPES緩衝液(pH7.2)0.67 mmol/Lとした．

3.　被験物質

二クロム酸ナトリウム二水和物(ロット番号:10205K1，日本化学工業(株)(東京))は，純度100.07 %(不純物としてSO4 0.07 %，Cl 0.008 %，Ca 6 ppmを含む)の橙黄色の固体，結晶であり，通常の取り扱い条件においては安定な物質で，室温で保管した．本物質は水に溶解(20 ℃で水100 gに対し273 g)した．被験物質原体は，試験後の分析によって試験期間中，室温で安定であったことが確認された．

4.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．溶媒として日局注射用水(DW，ロット番号:K1C75，(株)大塚製薬工場)を用いて原液を調製した．原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の10 vol%になるように加えた．

5.　培養条件

2 × 104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm)に播き，CO2インキュベーター内で3日間培養した．その後，連続処理では，新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，S9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

6.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．培養終了後，細胞を10 vol%ホルマリン水溶液で固定し，0.1 w/v%クリスタルバイオレット水溶液で染色した．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の媒体対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後 18時間の回復時間)した場合，50 %の増殖抑制濃度はそれぞれ0.0083 mg/mLおよび0.18 mg/mLとなった．また，連続処理(24時間処理)した場合は0.0011 mg/mLとなった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，短時間処理(6時間)のS9 mix非存在下およびS9 mix存在下における短時間処理では，それぞれ0.018 mg/mLおよび0.18 mg/mLを最高処理濃度とし，公比2で各5濃度を設定した(S9 mix非存在下:0.0011〜0.018 mg/mL，S9 mix存在下:0.011〜0.18 mg/mL)．その結果，毒性が強く，観察に必要な3濃度群がとれなかったことから，2回目の処理ではS9 mix非存在下では0.0090 mg/mLを最高濃度に，S9 mix存在下では0.090 mg/mLを最高濃度に公比2で各5濃度を設定した(S9 mix非存在下:0.00056〜0.0090 mg/mL，S9 mix存在下:0.0056〜0.090 mg/mL)．

また，陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業(株))およびシクロホスファミド(CP，Sigma Chemical Co.)は，日局注射用水((株)大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験において，溶媒対照群と処理群では1濃度あたり4枚のディッシュを用いた．このうちの2枚で染色体標本を作製し，残りの2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わな かった．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本は3 vol%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数を細胞毒性の指標として，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1, 2)，S9 mix非存在下では，観察可能な最高濃度が0.0023 mg/mLであったことから0.00056，0.0011，0.0023 mg/mLの3濃度を，S9 mix存在下では，観察可能な最高濃度が0.023 mg/mLであったことから0.0056，0.011，0.023 mg/mLの3濃度を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　判定

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッ シャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

二クロム酸ナトリウム二水和物を加えてS9 mix非存在下で短時間処理した結果，0.00056 mg/mL，0.0011 mg/mL，0.0023 mg/mLの全濃度群においてそれぞれ11.5 %，21.5 %，40.5 %の染色体異常が誘発された(gapを除く)．一方，倍数性細胞の誘発は求められなかった(Table 1)．

また，S9 mix存在下で短時間処理した結果，低濃度群(0.0056 mg/mL)では染色体異常の誘発は認められなかった(溶媒対照1.0 %に対し2.0 %，gapを除く)が，中濃度群(0.011 mg/mL)および高濃度群(0.023 mg/mL)では，それぞれ9.5 %および50.5 %の染色体異常が誘発された(gapを除く)．一方，倍数性細胞の誘発は認められなかった(Table 2)．

以上のように，二クロム酸ナトリウム二水和物で短時間処理を行った場合，明らかに陽性の結果が得られたことからD20値4)を求めたところ，S9 mix非存在下では0.00087 mg/mL，S9 mix存在下では0.0096 mg/mLとなった．短時間処理で陽性の結果が得られたため，24時間処理は行わなかった．

陽性対照物質として用いたMCは，S9 mix非存在下で処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1)，CPはS9 mix存在下で処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 2)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

なお，二クロム酸ナトリウム二水和物は，細菌を用いる復帰変異試験において陽性の結果が得られている5)．また関連物質であるクロム酸カリウム(無水物)についてはB. sub. rec+/rec-を用いたDNA修復試験，E. coli. Hs30Rを用いた復帰変異試験およびヒトリンパ球，シリアンハムスター細胞を用いた染色体異常試験で陽性の結果が報告されている6)ことから，クロム酸イオンは変異原活性を有すると考えられる．

以上の結果より，二クロム酸ナトリウム二水和物は，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発すると結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス，"朝倉書店，東京，1988, pp. 16-37.
2)吉村功編，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ，"サイエンティスト社，東京，1987, pp. 76-78.
3)吉村功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析，"地人書館，東京，1992, pp. 218-223.
4)石館基監修，"<改定>染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー，東京，1987, p. 23.
5)原巧ら，化学物質毒性試験報告，10, 412(2003).
6)賀田恒夫，石館基監修，"環境変異原性データ集1，"サイエンティスト社，東京，1980, p. 341.

連絡先
試験責任者：山影康次
試験担当者：高橋俊孝，田中憲穂，若栗　忍，橋本恵子，三枝克彦，加藤初美
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Kohji Yamakage(Study director)
Toshitaka Takahasi, Noriho Tanaka, Shinobu Wakuri, Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627