テトラメチルアンモニウムヒドロキシドのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test
of Tetramethylammonium hydroxide in Rats

要約

テトラメチルアンモニウムヒドロキシドの28日間反復経口投与毒性試験(回復14日間)を雌雄のSprague-Dawley系ラットを用いて実施した.投与量は雌雄とも0(対照群),5,10および20 mg/kgとし,0および20 mg/kg投与群は回復試験の動物を含む1群10匹,5および10 mg/kg投与群は1群5匹を使用して試験を行った.

その結果,いずれの投与群においても死亡例は認められなかった.一般状態の変化として,投与第6日以降,10 mg/kg以上の投与群で投与直後の流涎が繰り返して観察された.この流涎は,投与後1時間以内に消失する一過性の症状であったが,投与第13日以降には,雄の10 mg/kg以上の投与群および雌の20 mg/kg投与群で投与後1時間以上継続して観察される例があった.10 mg/kg投与群の雄および20 mg/kg投与群の雌雄では,投与第1週の摂餌量が低値を示した.また,回復期間中に被験物質投与群の雄の摂餌量は高値を示し,回復第1週には有意な差が認められた.回復第2週の尿検査では,被験物質投与群の雄における電解質排泄量に増加がみられたが,投与第4週の尿検査所見には被験物質投与に起因したと考えられる変化はなかった.血液学検査および血液生化学検査所見には,被験物質投与に起因したと考えられる変化は認められなかった.器官重量では,投与期間終了時の雄の心臓重量が用量に依存して減少した.すなわち,絶対重量は5 mg/kg以上の投与群で,相対重量は10 mg/kg以上の投与群で,いずれも有意な減少が認められた.一方,投与期間終了時の雌および回復期間終了時の雌雄の器官重量には,いずれも有意な差は認められなかった.また,病理組織学所見には,被験物質投与に起因したと考えられる変化は観察されなかった.

以上のことから,本試験条件下におけるテトラメチルアンモニウムヒドロキシドの無影響量は,雄では5 mg/kg/day未満,雌では5 mg/kg/dayであると判断された.

方法

1. 被験物質

被験物質として,昭和電工(株)(福島)より提供されたテトラメチルアンモニウムヒドロキシドの20.19 %水溶液(ロット番号:81029)を用いた.提供された水溶液は無色透明の液体で,不純物として炭酸根3 ppm,塩化物0.17 ppmを含有していた.被験物質は,使用時まで室温で保管した.なお,被験物質の試験期間中の安定性は,残余被験物質を提供元で再分析することにより確認した.

投与検体は,被験物質を局方注射用水(製造番号:9707SA,光製薬(株))で希釈してテトラメチルアンモニウムヒドロキシド濃度として0.2 w/v%溶液を調製し,これを注射用水により各濃度に段階希釈した.なお,初回に調製した各濃度の投与検体の含量測定を実施した結果,溶液中の被験物質の平均含量は,所定濃度の100〜101 %であった.また,本被験物質の溶媒中の安定性を確認するための分析法の確立が困難であったため,安定性試験は実施せず,投与検体は用時調製とした.

2. 動物および飼育方法

試験には,生後4週で購入し,検疫を兼ねて8日間予備飼育した雌雄のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD(SD)IGS,日本チャールス・リバー(株))各30匹を使用した.

群分けは,検疫期間中に異常がなかった動物を用い,投与開始前日の体重に基づいて体重別層化無作為抽出法により行った.動物数は,雌雄とも対照群および高用量群を各10匹とし,低および中用量群を各5匹とした.

動物は,温度24 ± 1 ℃,湿度50〜65 %,換気回数約15回/時,照明12時間(7〜19時点灯)に設定した飼育室内で,金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し,固型飼料(CE-2,日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水)を自由摂取させて飼育した.

3. 投与量の設定および投与方法

本試験の投与量は,投与量設定のための予備試験と急性経口投与毒性予備試験の結果に基づき決定した.すなわち,20 mg/kgを5日間反復投与することにより雄3例中1例で,腺胃粘膜の肥厚が観察されたが,5および10 mg/kgを7日間反復投与しても何ら変化がみられなかった.一方,急性経口投与毒性予備試験として,25 mg/kgを単回投与したところ,半眼および自発運動の減少等が散見され,雄3例中1例では投与翌日の体重が減少した.これらのことから20 mg/kg投与群は,被験物質による毒性影響が認められ,かつ28日間の反復投与に耐えうる用量であると判断し,本試験の用量は,高用量を20 mg/kgとし,以下公比2で除して10および5 mg/kgを中用量および低用量とした.また,雌雄とも媒体である注射用水を投与する対照群を設けた.

投与経路は強制経口投与とし,1日1回,28日間,ラット用胃管を用いて投与した.投与容量は10 mL/kgとし,投与液量は雌雄とも最近時の体重をもとに個体別に算出した.なお,回復期間は14日間とした.

4. 観察および検査

1) 一般検査

毎日(投与期間中は投与前および投与後)全例の一般状態を観察した.また,体重は,投与第1週の第1日の投与直前と5日,投与第2週以降回復期間終了週までは1週に2回の頻度で測定し,その他,投与期間終了日,回復期間終了日および剖検日にも測定した.摂餌量は,投与第1週では,投与第1日から2日にかけて1日あたりの摂餌量を測定し,以後回復期間終了週まで毎週1回の頻度で測定した.

2) 尿検査

各群とも全例について,投与第4週および回復第2週に代謝ケージに収容して蓄尿し,約4および24時間の時点で採尿した.この4時間尿を用いて,pH,潜血,蛋白,糖,ケトン体,ビリルビン,ウロビリノーゲンを試験紙法(クリニテック200+,バイエル・三共(株))により,また色調および濁度を視診により検査し,24時間尿を用いて,尿量(天秤で重量を計測し,比重で除す),比重(単位体積あたりの重量を測定)を測定したほか,全自動電解質分析装置(EA05,(株)A&T)により,ナトリウム,カリウムおよび塩素濃度(イオン電極法)を測定した.

3) 血液学検査

投与期間ないし回復期間終了日から翌日の剖検日にかけて定期解剖例全例を18から24時間絶食させ,ペントバルビタールナトリウム麻酔下で腹部後大静脈よりEDTA 2Kを抗凝固剤として採血し,Coulter Counter Model S-PLUS(コールターエレクトロニクス(株))により赤血球数,白血球数,平均赤血球容積,血小板数(以上,電気抵抗法)および血色素量(吸光度法)を測定し,これらを基にヘマトクリット値,平均赤血球血色素量および平均赤血球血色素濃度を算出した.血液の一部は塗抹標本とし,白血球分類(Wright-Giemsa染色)および網状赤血球比率(Brecher法)を求めた.また,クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採取した血液をCA-1000(東亜医用電子(株))によりプロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間(光散乱検出法)を測定した.

4) 血液生化学検査

血液学検査用の採血に引き続き,ヘパリンを抗凝固剤として採血し,血漿を分離して遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA,ロシュ・ダイアグノスティックス(株))により,総蛋白濃度(ビウレット法),アルブミン濃度(BCG法),総コレステロール濃度(COD・DAOS法),ブドウ糖濃度(グルコキナーゼ・G6PDH法),尿素窒素濃度(ウレアーゼ・Gl.DH法),クレアチニン濃度(Jaff法),アルカリフォスファターゼ活性(GSCC法),GOT活性(IFCC法),GPT活性(IFCC法),γ-GTP活性(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法),トリグリセライド濃度(GPO・DAOS法),無機リン濃度(モリブデン酸直接法),カルシウム濃度(OCPC法)を測定し,A/G比を算出した.また,全自動電解質分析装置(EA05,(株)A&T)により,ナトリウム濃度,カリウム濃度および塩素濃度(イオン電極法)を測定した.

5) 病理学検査

上記の採血に引き続き,動物を放血屠殺したのち,器官および組織の肉眼的観察を行った.また,各動物の脳,胸腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,卵巣または精巣,精巣上体の重量測定を行い,各器官重量を剖検日の体重で除して,それぞれの相対重量を算出した.さらに,脳,下垂体,脊髄,眼球,甲状腺,上皮小体,心臓,気管,気管支,肺,肝臓,腎臓,胸腺,脾臓,副腎,胃,十二指腸,空腸,回腸,盲腸,結腸,直腸,前立腺,精嚢,卵巣,子宮,腟,乳腺,膀胱,下顎リンパ節,腸間膜リンパ節,骨格筋(下腿部),坐骨神経,大腿骨骨髄,膵臓,顎下腺,舌下腺,舌,食道,大動脈,ハーダー腺,皮膚,病変部を0.1 mol/Lリン酸緩衝10 vol%ホルマリン溶液(pH 7.2)に固定し,精巣,精巣上体はブアン液に固定した.心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,胃,精巣,精巣上体,卵巣および病変部はパラフィン包埋後,ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し,先ず,対照群および高用量群について病理組織学検査を実施した.次いで,被験物質投与による影響が疑われた雄の腎臓について,全例の病理組織学検査を実施した.この他,肉眼的異常が認められた器官・組織についても病理組織学検査を実施した.

5. 統計解析

体重,摂餌量,尿検査(半定量検査を除く)および定期解剖例の血液学検査,血液生化学検査ならびに器官重量について,群ごとに平均値および標準偏差を求めた.また,試験群が3群以上の場合は,Dunnett法で多重比較を行い,2群の場合には,Studentのt検定ないしAspin-Welchのt検定を行った.さらに,病理組織学検査所見は,グレード分けしたデータについてMann-WhitneyのU検定を,陽性グレードの合計値についてFisher直接確率の片側検定を行った.なお,これら対照群および被験物質投与群との間の有意差検定はいずれの場合も有意水準を5 %とした.

結果

1. 一般状態

投与第6日以降,投与後1時間以内に消失する投与直後の一過性の流涎が,5 mg/kg投与群の雄1例,10 mg/kg投与群の雄4例,雌5例,20 mg/kg投与群の雄8例,雌9例に認められた.また,投与第13日以降には,流涎が投与後1時間以上継続して観察される例もあり,その例数は,10 mg/kg投与群の雄1例,20 mg/kg投与群の雄5例,雌6例であった.これらの流涎は,5 mg/kg投与群を除き,投与により繰り返して観察されることが多かった.また,個体によっては投与時の保定の段階でみられることがあった.さらに,20 mg/kg投与群の雌1例では,投与1時間後から流涎が認められることもあった.その他,10 mg/kg投与群の雄1例では,投与第12日以降,片側眼球の暗色化が認められた.なお,投与期間および回復期間中に死亡例はなかった.

2. 体重(Fig. 1, 2)

観察期間中,被験物質投与群では,雌雄いずれにおいても対照群との間に体重の有意な差は認められなかった.

3. 摂餌量(Fig. 3)

10 mg/kg投与群の雄および20 mg/kg投与群の雌雄では,投与第1週の摂餌量が対照群と比較して有意な低値を示したが,その後の投与期間中には,いずれの被験物質投与群においても有意な差は認められなった.一方,回復期間中,被験物質投与群の雄の摂餌量は高値を示し,回復第1週には有意な差が認められた.

4. 尿検査(Table 1)

投与第4週の検査では,いずれの検査項目においても,対照群と被験物質投与群の間に著しい差は認められなった.回復第2週の検査では,被験物質投与群の雄における電解質排泄量に有意な増加が認められた.

5. 血液学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査では,20 mg/kg投与群の雄にプロトロンビン時間の短縮がみられた以外,対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなかった.また,回復期間終了時の検査では,被験物質投与群の雌雄に赤血球数の有意な減少がみられたほか,雄では網状赤血球比率,平均赤血球容積および平均赤血球血色素量の増加と血小板数の減少が,また,雌では血色素量の減少および活性部分トロンボプラスチン時間の短縮が認められた.

6. 血液生化学検査(Table 3)

投与期間終了時の検査では,いずれの検査項目においても,対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなった.回復期間終了時の雄では,総蛋白濃度の有意な低下が認められたが,他の検査項目には対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなかった.

7. 病理学検査

1) 肉眼所見

(1) 投与期間終了時解剖例

片側眼球の暗色部が10 mg/kg投与群の雄1例に,腎臓の嚢胞が対照群の雌1例に,脾臓の小型化が20 mg/kg投与群の雌1例に観察された.

(2) 回復期間終了時解剖例

腎臓の大型化と皮質の淡色部が20 mg/kg投与群の雄1例に,片側の精巣および精巣上体の小型化が対照群の1例に観察された.

2) 器官重量(Table 4)

投与期間終了時解剖例の5 mg/kg以上の投与群の雄では,心臓の絶対重量に有意な減少がみられ,10 mg/kg以上の投与群では,相対重量にも有意な減少が認められた.一方,回復期間終了時解剖例の器官重量には,いずれも有意な差は認められなかった.

3) 病理組織学検査(Table 5)

(1) 投与期間終了時解剖例

腎臓の近位尿細管に軽度な好酸性小体が20 mg/kg投与群の雄2例に観察されたほか,腎臓,脾臓あるいは心臓に所見が観察されたが,いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められなかった.なお,肉眼的に病変がみられた部位の所見として,片側眼球に暗色部がみられた10 mg/kg投与群の雄1例では硝子体の出血が,腎臓に嚢胞がみられた対照群の雌1例では皮質の嚢胞が,脾臓の小型化がみられた20 mg/kg投与群の雌1例では,髄外造血の消失がそれぞれ認められた.

(2) 回復期間終了時解剖例

雄の腎臓の近位尿細管に軽微から軽度な好酸性小体が,対照群2例,被験物質投与群3例に観察されたほか,自然発生性の所見が観察されたが,いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められなかった.なお,肉眼的に病変がみられた部位の所見として,片側の精巣および精巣上体の小型化がみられた対照群の1例では,精巣の精細管萎縮および精巣上体の精子減少が観察されたが,腎臓の大型化と皮質の淡色部がみられた20 mg/kg投与群の雄1例では,これに対応すると考えられる変化は認められなかった.

考察

テトラメチルアンモニウムヒドロキシドを,5,10および20 mg/kgの用量で雌雄のSprague-Dawley系ラットに28日間にわたって強制経口投与し,その後14日間の回復期間を設けた.

その結果,投与第6日以降,被験物質投与群に投与直後の流涎が認められた.この流涎は,投与後1時間以内に消失する一過性の症状であったが,投与第13日以降には,雄の10 mg/kg以上の投与群および雌の20 mg/kg投与群では,投与後1時間以上継続して観察される例があった.流涎は,テトラメチルアンモニウムヒドロキシドの急性経口投与毒性試験の高用量群(50 mg/kg)でも観察されており,被験物質投与による影響と考えられる.流涎の成因としては,テトラメチルアンモニウムヒドロキシドの0.2 w/v%水溶液のpHは12.5という強アルカリ性であることから,投与検体の刺激性による変化とも考えられるが,低用量の投与検体濃度でもpHはほとんど変わらないことから,その可能性は少ないと考えられる.一方,テトラメチルアンモニウム塩は神経節興奮薬(脱分極性薬物)であり,一部ムスカリン様作用を有する1)ことから,被験物質の自律神経系に対する作用によって,唾液の分泌が亢進した可能性がある.なお,流涎以外に,便の性状あるいは瞳孔等には変化は認められなかった.また,5 mg/kg投与群の雄1例に認められた流涎は,1回のみで,投与の保定の段階でみられていることから,被験物質の作用による症状ではなく,投与操作に反応した変化と考えられる.

10 mg/kg投与群の雄および20 mg/kg投与群の雌雄では,投与第1週の摂餌量が低値を示した.この変化は,用量依存的であることから被験物質投与によるものと考えられるが,観察期間中の体重には変化はなく,その影響は軽微なものであった.一方,回復期間中の被験物質投与群の雄の摂餌量が高値を示した.その成因については不明であるが,被験物質投与中止による変化と考えられる.また,回復第2週の尿検査で,被験物質投与群の雄の電解質排泄量に増加がみられたが,この所見は,前述の回復期間になってからの摂餌量の増加に伴う変化の可能性がある.

回復期間終了時の血液学検査所見として,被験物質投与群の雌雄に赤血球数の減少がみられたほか,雄では網状赤血球比率,平均赤血球容積および平均赤血球血色素量の増加と血小板数の減少が,雌では血色素量の減少がそれぞれ認められた.これらの変化は,いずれも投与期間終了時には対照群との差はなく,また,生理的変動範囲内の軽微な変化であることから,毒性学的意義は少ないものと考えられる.この他,血液および血液生化学の検査項目のうち,対照群と被験物質投与群との間に有意差の認められた血液凝固時間は,短縮方向の変化であったこと,総蛋白濃度の低下は,回復期間終了時のみの変化であり,他の関連所見もなかったことから,いずれも被験物質投与およびその後に続く回復期間に関連がない変化と考えられる.

器官重量では,投与期間終了時に雄の心臓重量が用量に依存して減少したが,高用量群における組織学所見には対照群との差はなかった.前述のように,テトラメチルアンモニウム塩は神経節興奮薬であり,神経節のシナプス後膜を脱分極させることにより,節後ニューロンの興奮を起こし,次いで脱分極性の遮断を起こすことが知られており1),また,ラットの心臓に対してムスカリン様作用を有することが報告されている2).これらのことから,今回の試験でみられた雄の心臓重量の減少は,被験物質投与による降圧,心筋の収縮力低下,心拍数の減少等心臓に対する負荷の軽減によって生じた可能性があるが,その詳細については不明である.

その他,病理学検査所見として,投与期間終了時に,20 mg/kg投与群の雄2例で腎臓の近位尿細管に好酸性小体が観察されたが,この所見は,雄ラットに特徴的な自然発生性病変であり3),回復期間終了時の検査では,対照群でも認められていることから,投与期間終了時に観察された変化は,自然発生性のもので,被験物質投与に起因した変化ではないと考えられる.

以上のように,テトラメチルアンモニウムヒドロキシドを反復投与することにより,10 mg/kg以上の用量では,投与後の流涎がみられ,20 mg/kgの用量では,流涎が1時間以上継続して認められる例が多かった.また,雄では心臓の重量が用量依存的に減少し,5 mg/kg以上の用量で絶対重量に有意な差が認められた.したがって,本試験条件下におけるテトラメチルアンモニウムヒドロキシドの無影響量は,雄では5 mg/kg/day未満,雌では5 mg/kg/dayであると判断された.

文献

1)伊藤宏,“薬理学,”三須良実編,第6版,栄光堂,東京,1986, p.200.
2)R. H. Kennedy, R. P. Wyeth, P. Gerner, S. Liu, H. J. Fontenot, E. Seifen, Am. J. Physiol., 268(Cell Physiol. 37), C1414(1995).
3)伊東信行,“最新毒性病理学,”中山書店,東京,1994, p.206.

連絡先
試験責任者:畔上二郎
試験担当者:森村智美,加藤博康,関 剛幸,新藤智子,永田伴子,吉村愼介,堀内伸二,稲田浩子,三枝克彦,安生孝子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Jiro Azegami(Study Director)
Tomomi Morimura, Hiroyasu Katoh, Takayuki Seki, Tomoko Shindo, Tomoko Nagata, Shinsuke Yoshimura, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627