)を入れたプラスチック製ケージに個別に移し，自然分娩および哺育をさせた．飼料は固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業)を，飲料水は水道水をいずれも自由に摂取させた．なお，剖検前日の午後4時からは絶食とした．
雌においては，1000 mg/kg群で死亡例が1例認められた．1000 mg/kg群では，歩行異常および被毛の汚れがみられた．体重は，1000 mg/kg群で交配前，妊娠期および哺育期に増加抑制がみられた．摂餌量は，1000 mg/kg群で交配前に低値がみられた．剖検では，1000 mg/kg群で胸腺の萎縮がみられた．死亡例では，胸腺の萎縮と副腎の肥大がみられた．器官重量では，100および300 mg/kg群で腎臓の相対重量の高値がみられた．1000 mg/kg群で腎臓の絶対重量，甲状腺，肝臓および腎臓の相対重量の高値，肝臓の絶対重量の高値傾向がみられた．病理組織学検査では，1000 mg/kg群で胸腺の皮質あるいは髄質の萎縮，脾臓に髄外造血の低下と延髄の軟化巣がみられた．死亡例において，膵臓に腺房細胞のチモーゲン顆粒減少，胸腺に皮質および髄質の萎縮，脾臓に髄外造血の低下および白脾髄の萎縮，延髄の軟化巣，骨髄の造血低下がみられた．
総出産児数，分娩率，哺育0日の新生児数，児の産出率，出生率，性比，哺育4日の新生児数および哺育4日の生存率では，300 mg/kg群で哺育0日の新生児数の低値がみられた．1000 mg/kg群では，総出産児数，哺育0日の新生児数，児の産出率，出生率，哺育4日の生存児数および生存率の低値がみられた．外表観察では，投与による影響はみられなかった．体重では，1000 mg/kg群で哺育0日の雌雄の低値がみられた．剖検では，投与に起因すると思われる変化はみられなかった．
以上のように，2-エチルヘキシルメタクリラートの一般毒性学的無影響量は，雄では300 mg/kg投与により腎臓の絶対重量および相対重量の高値が認められたことから 100 mg/kg/day，雌では100 mg/kg投与により腎臓の相対重量の高値が認められたことから30 mg/kg/dayと考えられる．また，生殖発生毒性学的な無影響量は，雄では交尾および受胎能に影響が認められなかったことから1000 mg/kg/day，雌では1000 mg/kg投与により黄体数および着床痕数の低値が認められたことから300 mg/kg/day，児動物の発生では300 mg/kg投与により哺育0日の新生児数の低値が認められたことから100 mg/kg/dayと考えられる．
，純度:99.4 ％)．入手後は，冷蔵・遮光条件下で保管した．なお，投与期間終了後に被験物質の一部を製造元に送付して分析した結果，使用期間中の安定性が確認された．被験物質は，コーンオイルに希釈して調製した．なお，6，20および200 mg/mLの調製液は，調製後冷蔵・遮光条件下で7日間，さらに室温・遮光条件下で4時間保存しても安定性に問題のないことが確認されていたため，各濃度の調製液は調製後，冷蔵・遮光条件下で保管し，調製後7日以内に使用した．被験物質は純度による換算を行って調製した．
から購入した．入手した動物は，5日間の検疫期間およびその後7日間の馴化期間を設け，一般状態および体重推移に異常がみられず，また性周期観察で異常が認められなかった動物を群分けして試験に用いた．群分けは，コンピュータを用いて体重を層別に分けた後に，無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように投与開始日に行った．1 群の動物数は，雌雄各 12 匹とした．
動物は，室温20〜24℃，湿度40〜70 ％，明暗各12時間(照明:午前6時〜午後6時)，換気回数12回／時に設定した飼育室で飼育した．検疫・馴化期間中はステンレス製ケージを用いて1ケージあたり5匹までの群飼育とし，群分け後はステンレス製ケージを用いて個別飼育した．また，母動物は，妊娠18日にオートクレーブ処理した床敷(サンフレーク，日本チャールス・リバー)を入れたプラスチック製ケージに個別に移し，自然分娩および哺育をさせた．飼料は固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業)を，飲料水は水道水をいずれも自由に摂取させた．なお，剖検前日の午後4時からは絶食とした．
投与量は，先に実施した雄ラットを用いた2週間経口投与による予備試験(投与段階:0，125，250，500および1000 mg/kg，各群5例)の結果により決定した．すなわち，125 mg/kg以上の群で投与直後に流涎が，1000 mg/kg群で体重の低値がみられたが，各群とも死亡発現は認められなかった．そこで，当試験の投与量は，1000 mg/kgを最高用量とし，以下公比約3で300，100 および30 mg/kgとした．また，対照として被験物質投与群の投与液と同一容量の媒体(コーンオイル)のみを投与する群を設けた．
3時間尿:色調は，外観判定とした．pH，蛋白，糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンは，エームスクリニテック用検査紙(マイルス・三共)に尿を滴下後にエームス尿分析器(クリニテック200，マイルス・三共)を用いて検査した．尿沈渣は，沈渣を尿沈渣染色液で染色後に顕微鏡下で観察した．
21時間尿:比重を屈折率により屈折型尿比重計(ユリペット-
D，ニコン)を用いて測定した．
24時間尿:尿量を比重と重量から算出した．
赤血球数(RBC)，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，血小板数および白血球数(WBC)は，EDTA-2KコーティングしたSysmexサンプルカップに採取した血液について，多項目自動血球計数装置(Sysmex K-4500，東亜医用電子)を用いて測定した．さらに，平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．
網状赤血球数(RET)は，EDTA-2K処理した血液をBrecher法により超生体染色してスライドグラスに塗抹後，Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で赤血球 1000個中の数を計数した．
白血球百分率は，EDTA-2K処理した血液をスライドグラスに塗抹し，May-Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で白血球100個を分類計数した．
プロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびフィブリノーゲン濃度は，3.13 ％クエン酸ナトリウムで処理した血漿について，散乱光検出方式により血液凝固分析装置(コアグマスター，三共)を用いて測定した．
GOTおよびGPTはHenry変法，ALPはρ-NPP基質法，γ-GTPはγ-G-P-NA基質法，総蛋白はBiuret法，総ビリルビンはAzobilirubin法，尿素窒素(BUN)はUrease・GlDH法，クレアチニンはJaff
法，ブドウ糖はGlucose dehydrogenase法，総コレステロールはCOD・DAOS法，トリグリセライドはGPO・DAOS法，Caはο-CPC法，無機リンはMolybdenum blue法により，自動分析装置(AU 500，オリンパス光学工業)を用いて測定した．
NaおよびKはイオン選択電極法により，Clは電量滴定法により，いずれも全自動電解質分析装置(EA04，A & T)を用いて測定した．
蛋白分画は，電気泳動法により自動電気泳動装置(AES 600，オリンパス光学工業)を用いて測定した．
アルブミン量は総蛋白量および蛋白分画値から，A/G比は蛋白分画値から算出した．
交尾確認は毎朝ほぼ一定時刻に行い，腟垢内に精子または腟栓を確認した雌を交尾成立動物として，その日を妊娠0日として起算した．
体重(親動物，新生児)，摂餌量，発情回数，交尾所要日数，妊娠期間［分娩日(哺育0日)-交尾確認日］，着床痕数，総出産児数(新生児数＋死産児数)，新生児数，分娩率［(総出産児数／着床痕数)×100］，児の産出率［(哺育0日の新生児数／着床痕数)×100］，黄体数，着床率［(着床痕数／黄体数)×100］，出生率［(哺育0日の新生児数／総出産児数)×100］，哺育4日の新生児数，哺育4日の生存率［(哺育4日の新生児数／哺育0日の新生児数)×100］，外表異常出現率［(外表異常児数／新生児数)×100］，性比(雄／雌)，器官重量(相対重量を含む)，尿量，尿比重，血液学検査成績，血液生化学検査成績については，各群で平均値および標準偏差を算出した．有意差検定は，Bartlett法による等分散性の検定を行い，等分散ならば一元配置法による分散分析を行い，有意ならばDunnett法を用いて行った．一方，等分散と認められなかった場合は，順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallisの検定)を行い，有意ならば順位を利用したDunnett型の検定法を用いて行った．
交尾率［(交尾成立動物数／同居動物数)× 100］，受胎率［(受胎雌数／交尾成立動物数)× 100］，出産率［(新生児出産雌数／受胎雌数)× 100］は，χ^2検定を用いた．
なお，病理組織学検査において，1000 mg/kg群で毒性学的影響が示唆され他の用量群についても検査を実施した器官・組織の所見については，上記の順位を利用したDunnett型の検定法を用いて行った．そこで有意差が認められた所見については，Cochran・Armitageの傾向検定を用いて用量反応性の検定を実施した．
一般状態観察において，対照群では，観察期間を通していずれの動物にも異常はみられなかった．30 mg/kg以上の群では，流涎が投与後1〜3 例にみられた．1000 mg/kg群では，さらに被毛の汚れが1例にみられた．なお，流涎は，各群とも投与後約30分の間に観察され，投与を継続しても流涎の持続時間に変化はみられなかった．
色調，pH，蛋白，糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンおよび沈渣は，各投与群とも対照群とほぼ同程度であった．
腎臓の近位尿細管の硝子滴変性，精巣の片側性の精細管の萎縮，精巣上体の片側性の精子肉芽腫，精子減少および管腔内の細胞残渣がみられたが，対照群でも通常観察される変化であり，また少数例であることから，偶発的変化と判断した．
その他には，心臓，肺，気管，膵臓，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，胸腺，リンパ節(下顎・腸間膜)，副腎，膀胱，前立腺，精嚢，下垂体，甲状腺，上皮小体，脳(大脳・小脳・延髄)，脊髄，坐骨神経および骨髄(胸骨・大腿骨)では対照群および1000 mg/kg群とも異常はみられなかった．
1000 mg/kg群では，投与15日に1例が死亡した．死亡例では，流涎が投与2日から，歩行異常が投与8日から死亡前日までみられた．
生存例の一般状態観察において，対照群では観察期間を通していずれの動物にも異常はみられなかった．30 mg/kg以上の群で流涎が投与後にみられた．1000 mg/kg群では，さらに被毛の汚れが1例にみられた．
妊娠期間中では，30，100および300 mg/kg群の体重は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて妊娠14および21日に体重の有意な低値がみられた．
哺育期間中では，30，100および300 mg/kg群の体重は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて哺育0および4日に体重の有意な低値がみられた．
妊娠期間中では，各投与群の摂餌量は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．
哺育期間中では，30，100および300 mg/kg群の摂餌量は対照群と比べて有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて有意差は認められなかったが，哺育4日に摂餌量の低値傾向がみられた．
1000 mg/kg群の死亡例の剖検において，胸腺の萎縮と両側の副腎の肥大がみられた．
1000 mg/kg投与群の死亡例1例において，膵臓に腺房細胞のチモーゲン顆粒減少が軽度に，胸腺に皮質および髄質の萎縮が中等度に，脾臓に髄外造血の低下および白脾髄の萎縮が中等度に，脳に延髄の軟化巣が中等度に，骨髄に造血の低下が中等度にみられた．なお，剖検で観察された両側の副腎の肥大を示唆する変化はみられなかった．
各群の交尾率はいずれも100 ％であった．交尾所要日数は，各投与群とも対照群との間に有意差はみられなかった．受胎率は，各投与群と対照群との間に有意差はみられなかった．新生児が得られなかった受胎雌は，1000 mg/kg群で2例みられた．
30，100および300 mg/kg群では，対照群と比べて黄体数，着床痕数および着床率に有意差はみられなかった1000 mg/kg群では，対照群と比べて黄体数および着床痕数の有意な低値がみられた．
対照群，30，100 および300 mg/kg群では出産率は 100 ％であった．1000 mg/kg群では，2母動物で新生児が得られなかったため出産率は77.8 ％であった．対照群，30，100および300 mg/kg群では，哺育状態に異常はみられなかった．1000 mg/kg群では，乳腺の発育不良が1例みられ，哺育期に新生児が全例死亡した母動物が3例認められた．
30および100 mg/kg群では，対照群と比べて児の産出率，哺育0日の新生児数，出生率および性比に有意差はみられなかった．300 mg/kg群では，対照群と比べて哺育0日の新生児数の有意な低値がみられた．1000 mg/kg群では，対照群と比べて児の産出率，哺育0日の新生児数および出生率の有意な低値がみられた．
新生児の外表観察では，各群とも生存児に異常はみられなかった．死産児において，短尾が30 mg/kg群で1例に，尾の欠損が1000 mg/kg群で1例にみられたが，いずれも偶発例と判断した．
新生児の一般状態では，尾の外傷が30 mg/kg群で1例にみられたが，偶発例と判断した．
雄動物に関しては，死亡および瀕死例はいずれの群にもみられなかった．一般状態観察において，1000 mg/kg群では被毛の汚れがみられた．また，1000 mg/kg群では，摂餌量の低値と関連した体重の増加抑制がみられ，2-エチルヘキシルメタクリラートは1000 mg/kg投与で全身状態の悪化を来すと考えられる．なお，30 mg/kg以上の群で投与直後に一過性の流涎がみられたが，2-エチルヘキシルメタクリラートの刺激性に基づく変化と判断され，毒性症状とはみなさなかった．
血液学検査において，1000 mg/kg群で赤血球数，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値および白血球数の低値がみられた．同群では，病理組織学検査では骨髄に変化はみられないものの，脾臓に髄外造血の低下が認められていることから，2-エチルヘキシルメタクリラートの投与で造血機能および器質に障害が生じていると考えられる．
血液生化学検査において，1000 mg/kg群でアルブミン率，A/G比，尿素窒素およびClの高値，総蛋白，α3-グロブリン率およびβ -グロブリン率の低値，ならびにGOTおよびGPTの高値傾向がみられた．GOTおよびGPTの高い動物2例では，肝臓で病理組織学的に巣状壊死が認められていることから，2-エチルヘキシルメタクリラートの投与で肝臓に影響が生じると考えられる．なお，器官重量においても，300 mg/kg以上の群で肝臓の相対重量の高値が認められている．1000 mg/kg群で尿素窒素およびClの高値，ならびに300 mg/kg以上の群で腎臓の絶対重量および相対重量の高値がみられており，また，1000 mg/kg群で尿比重の高値が認められている．一方，病理組織学検査では腎臓に変化は観察されていないが，これらの指標から2-エチルヘキシルメタクリラートの投与で腎臓に機能的障害を引き起こす可能性があると考えられる．なお，300および1000 mg/kg群で下垂体の相対重量の高値がみられたが，下垂体に病理組織学的変化は認められなかった．
雌動物に関しては，1000 mg/kg群で死亡例が1例認められた．死亡例では，急激な体重減少，摂餌量の減少，歩行異常がみられ，剖検において胸腺の萎縮と両側の副腎の肥大が認められた．死亡例の病理組織学検査において，膵臓に腺房細胞のチモーゲン顆粒減少，胸腺に皮質および髄質の萎縮，脾臓に髄外造血の低下および白脾髄の萎縮，延髄の軟化巣，骨髄の造血低下がみられたが，これらの変化の多くは後述するように1000 mg/kg群の生存例においても同様に認められているか，あるいは増強した変化と考えられる．したがって，死因は，生存例と共通して認められた胸腺の萎縮，脾臓の髄外造血低下が増悪し，白脾髄の萎縮，骨髄の造血低下を来たし，全身状態の悪化を招来したことによると推定される．なお，歩行異常は，病理組織学検査で認められた延髄の軟化巣と関連した所見と考えられる．
一般状態観察においては，生存例で被毛の汚れがみられた．なお，雄の場合と同様に30 mg/kg以上の群で流涎がみられた．1000 mg/kg群では，雄と同様に摂餌量の低値と関連した体重の増加抑制が交配前投与期間，妊娠期間および哺育期間にみられた．器官重量では，100 および 300 mg/kg群で腎臓の相対重量の高値，1000 mg/kg群で腎臓の絶対重量の高値，甲状腺，肝臓および腎臓の相対重量の高値がみられた．病理組織学検査において，1000 mg/kg群で胸腺の皮質あるいは髄質の萎縮，脾臓の髄外造血の低下，延髄の軟化巣がみられ，1000 mg/kg投与で雌では胸腺，脾臓および脳への影響が生じると考えられる．しかし，甲状腺，肝臓および腎臓の絶対重量あるいは相対重量の変化は，病理組織学的な変化を来すほどのものではなかった．
したがって，当試験条件下における2-エチルヘキシルメタクリラートの一般毒性学的無影響量は，雄で100 mg/kg/day，雌で30 mg/kg/dayと考えられる．
なお，2-エチルヘキシルメタクリラートの類似化学物質であるメタクリル酸2-ヒドロキシエチルエステルのラットを用いる経口投与による反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験１）においても，1000 mg/kg群の雌で延髄広範囲軟化が認められている．また，2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートのラットを用いた経口投与による反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験２）においては，1000 mg/kg投与により雌雄で脳および脊髄の神経繊維の変性が報告されている．しかし，2-(ジエチルアミノ)エチルメタクリラートのラットを用いた経口投与による反復投与毒性および生殖発生毒性併合試験３）においては500 mg/kg投与により雌雄とも，ブチルメタクリラートのラットを用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験４）においては1000 mg/kg投与により雌雄とも，いずれも脳に病理組織学的変化は観察されなかったと報告されている．
親動物の生殖発生に対しては，30，100および300 mg/kg群では発情回数，交尾率，交尾所要日数，受胎率，受胎雌数，妊娠期間，分娩状態，黄体数，着床痕数，出産率および哺育状態に影響はみられなかった．1000 mg/kg群では，発情回数の低値，妊娠期間の延長がみられた．また，1000 mg/kg群では，新生児が全例死亡した母動物が多くみられ，黄体数および着床痕数の低値が認められた．なお，着床痕数の低値は黄体数の低値に伴う変化と考えられる．
新生児に対しては，30および100 mg/kg群では総出産児数，分娩率，哺育0日の新生児数，出生率，児の産出率，性比，一般状態，哺育4日の生存児数，生存率，体重，剖検にも影響はみられなかった．300 mg/kg群では，哺育0日の新生児数の低値がみられた．1000 mg/kg群では，総出産児数，児の産出率，哺育0日の新生児数および出生率の低値がみられた．1000 mg/kg群の母動物では，被毛の汚れを特徴とした一般状態の変化，体重の増加抑制，摂餌量の低値がみられていることから，母動物の全身状態の悪化により，黄体数の減少，死産児数の増加など，妊娠および分娩状態に影響を生じたものと考えられる．また，1000 mg/kg群では，哺育0日および哺育4日の雌雄の体重の低値がみられた．外表観察では，各投与群とも2-エチルヘキシルメタクリラート投与に基づくと考えられる異常はみられなかった．
したがって，当試験条件下における2-エチルヘキシルメタクリラートの生殖発生毒性学的な無影響量は，雄の生殖に関しては1000 mg/kg/day，雌の生殖に関しては 300 mg/kg/day，児動物の発生に関しては100 mg/kg/dayと推察される．
以上のように，2-エチルヘキシルメタクリラートの一般毒性学的無影響量は，雄では300 mg/kg投与により腎臓の絶対重量および相対重量の高値が認められたことから100 mg/kg/day，雌では100 mg/kg投与により腎臓の相対重量の高値が認められたことから30 mg/kg/dayと考えられる．また，生殖発生毒性学的な無影響量は，雄では交尾および受胎能に影響が認められなかったことから1000 mg/kg/day，雌では1000 mg/kg投与により黄体数および着床痕数の低値が認められたことから300 mg/kg/day，児動物の発生では300 mg/kg投与により哺育0日の新生児数の低値が認められたことから100 mg/kg/dayと考えられる．
| 1) | 古橋忠和ほか，化学物質毒性試験報告，5，529(1997)． |
| 2) | 松浦郁夫ほか，化学物質毒性試験報告，6，547(1998)． |
| 3) | 石田茂ほか，化学物質毒性試験報告，6，153(1998)． |
| 4) | 伊藤義彦ほか，化学物質毒性試験報告，6，81(1998)． |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 古橋忠和 | ||
| 試験担当者： | 長瀬孝彦，藤村高志，内藤一嘉，牧野浩平， 渡邊ゆかり，木村 均 | ||
| 日本バイオリサーチセンター 羽島研究所 | |||
| 〒 501-6251 岐阜県羽島市福寿町間島6-104 | |||
| Tel 058-392-6222 | Fax 058-392-1284 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Tadakazu Furuhashi(Study director) Takahiko Nagase, Takashi Fujimura, Kazuyoshi Naitou, Kohei Makino, Yukari Watanabe and Hitoshi Kimura | |||
| Nihon Bioresearch Inc. Hashima Laboratory | ||||
| 6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan | ||||
| Tel +81-58-392-6222 | Fax +81-58-392-1284 | |||