2,4-ジクロロニトロベゼンのラットを用いる
反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験

Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test of
2,4-Dichloronitrobenzene by Oral administration in Rats

要約

 2,4-ジクロロニトロベンゼンは化学産業の分野において有機合成や染料の原料として使用されている化合物であるが,本化合物のヒトや実験動物の生体に及ぼす影響についてはほとんど知られていない.一方,本化合物の類似物質であるニトロベンゼンやジニトロベンゼンについては,メトヘモグロビン形成能を有し,精巣の精細管上皮のセルトリ細胞に対して直接障害を及ぼすなど精巣毒性の認められる物質として報告されている.1- 4) 今回,2,4-ジクロロニトロベンゼンの毒性学的性質を評価するために反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験を行った.すなわち,2,4-ジクロロニトロベンゼンの0(溶媒対照),8 ,40および 200 mg/kg/dayをSprague-Dawley(Crj:CD(SD)) ラットの交配前 2週間および交配期間の 2週間を通じて経口投与し,さらに雄では交配期間終了後17日間,雌では妊娠期間を通じて分娩後の哺育 3日まで連続投与し,親動物の反復投与毒性および生殖能ならびに児動物の発生・発育に及ぼす影響について検討した.

1. 反復投与毒性

 雌の 200 mg/kg群で1例が分娩中に死亡した.雌の 200 mg/kg群で妊娠期間中に体重増加抑制が認められた.雄の血液学検査では,8 mg/kg 以上の投与群で赤血球数が低値を,40および 200 mg/kg 群でヘマトクリット値およびヘモグロビン量が低値を,網赤血球比率が高値を示した.40および 200 mg/kg群で血清総蛋白,アルブミンおよびγ-GTPが高値を,クレアチニンが低値を,さらに 200 mg/kg 群で総ビリルビンおよび A/Gが高値を示した.雌雄の 200 mg/kg群で肝臓,腎臓の実重量および相対重量が増加または増加傾向を示し,雌雄の 200 mg/kg群で肝臓の肥大が,雄の 200 mg/kg 群で腎臓の肥大が観察された.その他,胸腺の萎縮または副腎の肥大が雌の被験物質投与群で観察された.組織には,雌雄の 200 mg/kg群で肝細胞腫脹および単細胞壊死が観察され,さらに雄の同群で肝臓の核分裂像が観察された.また,腎臓に関しては,雄に尿細管上皮の硝子滴変性が,雌に好塩基性化が 200 mg/kg群にやや多く観察され,さらに雌では少数例ではあるが空胞化が 8 mg/kg以上の投与群で,尿細管上皮の壊死が 40 および 200 mg/kg群で観察された.200 mg/kg 群の死産児のみを娩出した雌および全児死亡の認められた雌に,脾臓の中等度の色素沈着,胸腺の萎縮,肝細胞腫脹,胃,十二指腸および大腸の潰瘍,肝臓の単細胞壊死,腎臓の尿細管上皮の壊死,好塩基性化,空胞化および線維化などが観察された.なお,対照群および 200 mg/kg群の精巣について,ステップ 8の精細管の精上皮細胞数を測定した結果,被験物質投与の影響は認められなかった.

2. 生殖発生毒性

 分娩時観察では,200 mg/kg 群で 1例が分娩中に死亡したのに加えて,同群で死産児のみを娩出した動物が 2例,哺育期間中に全児死亡が認められた動物が 3例観察され,出産生児数の減少,死産児数の増加傾向,出生率,新生児の哺育 4日生存率および分娩率の低値または低値傾向が認められ,分娩あるいは哺育機能の障害を惹起する可能性が示唆された.

 以上の結果から,本試験条件下における2,4-ジクロロニトロベンゼンの反復投与毒性に関する無影響量は,雌雄とも 8 mg/kg/day未満と判断される.また,雄の生殖に及ぼす影響は 200 mg/kg/day投与によっても認められず,無影響量は 200 mg/kg/dayと推察される.雌の生殖および児動物の発生・発育に及ぼす影響は 200 mg/kg/day投与で認められ,無影響量は 40 mg/kg/day と判断される.

方法

1. 被験物質

 2,4-ジクロロニトロベンゼン(CAS No.611-06-3,石原産業(株),Lot.No. 930812,純度 98.0%以上,分子量192.00,融点 33℃,沸点 258.5℃)は,黄色結晶の固体であり,使用時まで室温条件下で密封遮光保管した.

 被験物質は,コーンオイル(ナカライテスク(株))に溶解し,1.6,8 および40 mg/mlの濃度になるよう各群の投与液を調製した.調製後は,使用時まで冷暗条件下で密閉保管した.調製液中の被験物質は,1.6 mg/mlの場合,冷暗条件下で少なくとも 8日間安定であることが確認されている.

 投与液の濃度分析は,調製開始時に調製した各群のバッチから無作為にサンプルを抽出し実施した.その結果,設定濃度の102〜105%の範囲で調製されおり,ほぼ所定量の 2,4-ジクロロニトロベンゼンが含有されていたことを確認した.

2. 使用動物および飼育条件

 試験には,日本チャールス・リバー(株)から購入した8週齢のSprague-Dawley(Crj:CD(SD)), SPF)系雌雄ラットを使用した.購入した動物は 7日間検疫・馴化飼育した後,一般状態に異常が認められなかった動物を 8日間の予備飼育後,10週齢で群分けして試験に用いた.群分け終了時の体重は,雄で 352〜397 g ,雌で227〜253 gの範囲であった.

 動物は,温度22〜26℃,湿度45〜65%,換気回数15回/時間,照度 150〜300 lux,照明時間12時間(午前 7時点灯,午後 7時消灯)に設定されたバリアシステムの飼育室で飼育した.アルミ製前面・床ステンレス網目飼育ケージに動物を 1匹ずつ収容し飼育した.妊娠18日以降の母動物は哺育 4日までアルミ製前面・床ステンレス網目飼育ケージに哺育トレーおよび巣作り材料(アルファードライ)を入れて飼育した.

 飼料は,オリエンタル酵母工業(株)製造のNMF固型飼料(放射線滅菌飼料)を使用し,飼育期間中自由に摂取させた.飲水は,水道水を自由に摂取させた.供給した飼料,水および巣作り材料には試験に支障を来す可能性の考えられる夾雑物の混在はなかった.

3. 群分け

 雌雄とも投与開始日の体重をもとに層別化し,無作為抽出法により 1群当たり12匹を振り分けた.

4. 投与量,群構成,投与期間および投与期間

 本試験の用量は先に実施した予備試験の結果を参考にして決定した.すなわち,0, 50, 100, 200 および400 mg/kg を雄および雌に14日間連続投与した結果,400 mg/kg 群の雄で6例中1例,雌で6例中4例が死亡した.また,400 mg/kg 群の雄で体重の増加抑制および摂餌量の低値がみられた.剖検時の器官重量は,200 mg/kg 以上の投与群の雌雄で肝臓の実重量および相対重量がともに高値または高値傾向を示した.剖検では,100 mg/kg 以上の投与群の雄および 200 mg/kg以上の投与群の雌で肝臓の肥大がみられた.以上の結果をもとに,本試験の投与期間が長期間になることを考慮し,高用量として 200 mg/kg/dayを設定し,以下公比 5にて除し,中用量を40 mg/kg/day,低用量を 8 mg/kg/dayにそれぞれ設定した.

 投与経路は,OECDガイドラインに準じて強制経口投与とした.投与容量は,体重 100 g当り 0.5 mlとし,個体別に測定した最新体重に基づいて算出を行い,胃ゾンデを用いて毎日1回強制経口投与した.対照群にはコーンオイルのみを同様に投与した.

 雄の投与期間は,交配前14日間と交配期間の14日間および交配期間終了後17日間の連続45日間とした.雌の投与期間は,交配前14日間と交配期間中(交尾成立まで最長14日間)ならびに交尾成立後の妊娠期間を通じて分娩後の哺育 3日まで(41〜46日間)とした.なお,交尾の成立しなかった雌は交配期間終了後の解剖前日までの45日間とした.

5. 観察及び検査

1) 一般状態

 雌雄とも,全例について試験期間中毎日観察した.

2) 体重

 雄では,投与 1(投与開始日),8,15,22,29,36,43および46日(剖検日)に測定し,投与 1から43日までの体重増加量を算出した.雌では,投与 1(投与開始日),8 ,15および22日に測定し,投与 1から14日までの体重増加量を算出した.交尾の成立しなかった雌はそれ以後の投与29,36, 43日よび46日に測定した.交尾が成立した雌は,妊娠 0,7 ,14および21日に,分娩した雌は哺育0および 4日に測定し,それぞれ妊娠 0から21日および哺育 0から 4日までの体重増加量を算出した.

3) 摂餌量

 雄では,投与 1(投与開始日),8 ,15,22,29,36,43および45日(剖検前日)に餌重量を測定し,測定日から次の測定日までの間の摂餌量を求め平均 1日摂餌量を算出するとともに投与 1から15 日および投与22から45日までの累積摂餌量を算出した.雌では,投与 1(投与開始日),8 および15日に,交尾の成立しなかった雌はそれ以降の投与29,36および45日に餌重量を測定し,測定日から次の測定日までの摂餌量を求め平均 1日摂餌量を算出するとともに投与 1から15日までの累積摂餌量を算出した.また,交尾成立の雌は妊娠 0,7 ,14および21日に,分娩した雌は哺育 0および 4日に餌重量を測定し,測定日から次の測定日までの間の摂餌量を求め平均 1日摂餌量を算出するとともにそれぞれ妊娠 0から21日および哺育 0から 4日までの累積摂餌量を算出した.なお,交配期間中の摂餌量は測定しなかった.

4) 交配

 交配前 14日間の性周期観察を行った雌を同群内の雄のケージに入れ 1対 1で最長 2週間毎晩同居させた.翌朝,腟垢中の精子確認をもって交尾成立とし,その日を妊娠 0日とした.交配結果から,各群について交尾率[(交尾成立動物数/同居動物数)× 100]および受胎率[(受胎動物数/交尾成立動物数)×100)]を求めた.性周期の観察は交尾成立日まで行い,発情期から次の発情期までの間の日数を性周期日数とし平均性周期を算出した.

5)自然分娩時および新生児の観察

 交尾成立動物は全例を自然分娩させた.分娩の確認は妊娠20日から25日の午前 9〜10時の間に行い,この時間帯に分娩が完了していることを確認した個体についてその日を哺育 0日とした.午前10時を過ぎて分娩した場合は翌日を哺育 0日とした.分娩を確認した全例について妊娠期間(哺育 0日の年月日から妊娠 0日の年月日を減じた日数)および出産率[(生児出産雌数/受胎雌数)×100 ]を求めた.

 新生児は哺育 0日に出産児数(生存児+死亡児)を調べ,分娩率[(総出産児数/着床数)×100]および出生率[(出産生児数/総出産児数)×100] を求めた.生存児については性別を判定するとともに外表異常の有無を調べた.また,哺育 0および 4日に雌雄別の同腹児重量を測定し,雌雄別 1 匹当たりの平均重量を算出した.哺育 4日の新生児の同腹児重量を測定後に新生児全例をエ−テル麻酔により屠殺し,主要器官の肉眼観察を行った.なお,哺育期間中の死亡児についても同様に主要器官の肉眼観察を行った.また,新生児の 4日生存率[(哺育 4日生児数/出産生児数)× 100]を求めた.

6)臨床検査

 各群の雄全例について剖検時に実施した.動物を最終投与日(投与期間:45日間)の夕方から翌朝まで約16時間絶食させた後,エーテルで麻酔下で開腹し,腹部大動脈から採血した.

a)血液学検査

 検査はEDTA-3Kを添加した初血について,THMS H 6000 (テクニコン社)を用いて白血球数(WBC: 暗視野板法),赤血球数(RBC: 暗視野板法),ヘマトクリット値(HCT: 全赤血球の容積より補正),ヘモグロビン量(HGB: シアンメトヘモグロビン法),平均赤血球容(MCV:RBC, HCT より算出),平均赤血球血色素量(MCH:HGB, RBC より算出),平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB, HCT より算出),血小板数(PLT: 暗視野板法)および白血球百分率(フローサイトケミストリー法)を測定した.網赤血球(RC)比率の算定については網赤血球染色用ガラス毛細管キャピロット(テルモ(株))で染色後,血液塗抹標本を作製し鏡検した.

b)血液生化学検査

 検査はクリーンシール((株)ヤトロン)に血液を採取し,30 分間放置後 3,000 r.p.m. 7 分間遠心分離して得た血清について,多項目生化学自動分析装置CentrifiChem ENCORE II(ベーカー社)および EKTACHEM 700N(コダック社)を用いて総蛋白(ビューレット法),アルブミン(B.C.G.法),A/G (計算値),血糖(グルコースオキシダーゼ法),尿素窒素(ウレアーゼ改良法),クレアチニン(Jaff法),総ビリルビン(ジアゾ色素法),グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(Karmen改良法),グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(Karmen改良法),g-グルタミルトランスペプチダーゼ(Szasz 改法),カリウム(電極法),塩素(電極法),カルシウム(アルセナゾIII色素法)および無機リン(モリブデン酸アンモニウム法)を測定した.

6. 病理学検査

1) 剖検および器官重量

a) 死亡例

 剖検では主要器官の肉眼的観察を行い,皮膚,乳腺,リンパ節,唾液腺,胸骨,大腿骨(骨髄を含む),胸腺,気管,肺および気管支,心臓,甲状腺および上皮小体,舌,食道,胃,十二指腸,小腸,大腸,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,精嚢,前立腺,精巣,精巣上体,卵巣,子宮,膣,眼球,ハーダー腺,脳,下垂体および脊髄を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.

b) 雄動物

 45日間投与した日の夕方から餌を除き,約16時間の絶食させた翌日にエ−テル麻酔下で安楽死させた.剖検では主要器官の肉眼的観察を行い,胸腺,肝臓,腎臓,精巣および精巣上体重量を測定し器官重量・体重比(相対重量)を求めた.また,全動物の重量測定器官に加えて脳,心臓,脾臓,副腎,精嚢,前立腺,下垂体および病変部組織を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.なお,精巣および精巣上体はブアン氏液で固定した.

c) 自然分娩した雌

 哺育 4日にエーテル麻酔下で放血安楽死させた.剖検では主要器官の肉眼的観察を行った後,胸腺,肝臓,腎臓および卵巣重量を測定し器官重量・体重比(相対重量)を求めた.また,全動物の重量測定器官に加えて脳,心臓,脾臓,副腎,下垂体および病変部組織を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.剖検時に黄体数および着床数を調べ,着床率[(着床数/妊娠黄体数)× 100]求めた.

d) 交尾の成立しなかった雌

 45日間投与した翌日にエーテル麻酔下で放血安楽死させた.剖検では主要器官の肉眼的観察を行い,皮膚,乳腺,リンパ節,唾液腺,胸骨,大腿骨(骨髄を含む),胸腺,気管,肺および気管支,心臓,甲状腺および上皮小体,舌,食道,胃,十二指腸,小腸,大腸,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,卵巣,子宮,腟,眼球,ハーダー腺,脳,下垂体および脊髄を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.

e) 死産児のみを娩出した雌および全児死亡の認められた雌

 分娩確認日または生存児すべての死亡または喰殺が確認された日にエーテル麻酔下で放血安楽死させた.剖検では主要器官の肉眼的観察を行った後,皮膚,乳腺,リンパ節,唾液腺,胸骨,大腿骨(骨髄を含む),胸腺,気管,肺および気管支,心臓,甲状腺および上皮小体,舌,食道,胃,十二指腸,小腸,大腸,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,卵巣,子宮,腟,眼球,ハーダー腺,脳,下垂体および脊髄を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.

2) 病理組織学検査

a) 死亡例

 皮膚,乳腺,リンパ節,唾液腺,胸骨,大腿骨(骨髄を含む),胸腺,気管,肺および気管支,心臓,甲状腺および上皮小体,舌,食道,胃,十二指腸,小腸,大腸,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,精嚢,前立腺,精巣,精巣上体,卵巣,子宮,膣,眼球,ハーダー腺,脳,下垂体および脊髄について実施した.

b) 妊娠を成立させた雄

 全例の脳,胸腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,精巣および病変部組織について実施した.

c) 自然分娩した雌

 全例の脳,胸腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,卵巣および病変部組織について実施した.

d) 交尾の成立しなかった雌雄

 全例の脳,胸腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,腟,子宮,卵巣,精巣,精巣上体,精嚢,前立腺および下垂体について実施した.

e) 死産児のみを娩出した雌および全児死亡の認められた雌

 皮膚,乳腺,リンパ節,唾液腺,胸骨,大腿骨(骨髄を含む),胸腺,気管,肺および気管支,心臓,甲状腺および上皮小体,舌,食道,胃,十二指腸,小腸,大腸,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,卵巣,子宮,腟,眼球,ハーダー腺,脳,下垂体および脊髄について実施した.

3) 精細管の精上皮細胞の観察

 被験物質投与45日の交尾成立した雄の対照群および 200 mg/kg投与群のそれぞれ10および12例の精巣からHEおよび PAS染色標本を作製し,Russell ら5) および高橋ら6) の鑑別法に従いステージVIIIの精細管の精上皮細胞数を測定した.動物ごとに各5本のほぼ円形に横断された精細管について,精祖細胞(type A),プレレプトテン期精母細胞,パキテン期精母細胞,ステップ 8精子細胞およびセルトリ細胞数を数え,それぞれの総数からセルトリ細胞10個当りの細胞数を算出した.

7.統計解析

 体重,摂餌量,黄体数,着床痕数,出産児数,性比,平均性周期,妊娠期間,着床率,分娩率,出生率,外表異常発現率,新生児の 4日生存率,器官重量,器官重量・体重比(相対重量),血液学および血液生化学検査値についてはまず Bartlett の等分散検定8) を実施した.等分散の場合は一元配置分散分析を行った.分散が有意で各群の標本数が同数の場合は Dunnettの多重比較検定,各群の標本数が異なる場合は Scheffの多重比較検定で対照群と各投与群間の有意差を検定した.Bartlettの等分散検定で不等分散の場合は Kruskal-Wallis の順位検定を実施した.有意で各群の標本数が同数の場合は Dunnettの順位検定,各群の標本数が異なる場合は Scheffの順位検定で対照群と各投与群間の有意差を検定した.出産率,交尾率および受胎率についてはX^2 検定 9,10) を用いた.剖検所見で認められた肝臓の肥大および腎臓の肥大ならびに病理組織学検査で認められた肝臓および腎臓の異常所見についてはFisherの直接確率検定法10) を用いた.なお,哺育期間中の新生児に関する成績は 1母体当りの平均を 1標本とした.有意水準は* :P< 0.05 および**:P< 0.01 の 2段階とした.

結果

1. 反復投与毒性

1) 死亡および一般状態

 死亡例は,雄の対照群で投与 4週に 1例,雌の200mg/kg群で妊娠23日に 1例観察された。一般状態の観察では,雄で痂皮(顔面)が対照群で 1例,被毛の汚れ(下腹部)が200 mg/kg 群で 7例,眼分泌物が 40 および 200 mg/kg群で各 1例,流涎が 200 mg/kg群で 1例に観察された.雌では,被毛の汚れ(下腹部)および歯異常(上顎切歯折れ)が 200 mg/kg群で 5(交配および交配期間で 4例,妊娠期間で 4例)および 1例,脱毛(前肢)が対照群で 1例に観察された.

2) 体重(Figure 1,2)

 雄では投与期間を通じ対照群と被験物質投与群との間に差は認められなかった.雌では,200 mg/kg 群で対照群に比べ妊娠21日に低値を示し,妊娠 0から21日の間の体重増加量も低値を示したが,8 および 40 mg/kg 群では対照群と比べて差はなかった.

3) 摂餌量(Figure 3,4)

 雄では,200 mg/kg 群で対照群に比べ投与 8から15日,29から36日,36から43日および43から45日の平均 1日摂餌量が高値を示し,投与22から45日の間の累積摂餌量も高値を示した.8 および 40 mg/kg 群では対照群と比べて差はなかった.雌では,8 mg/kg 群で対照群に比べ投与 1から 8日,200 mg/kg 群で投与 8から15日の平均 1日摂餌量が高値を示し,40および 200 mg/kg群で投与 1から15日の間の累積摂餌量が高値を示した.妊娠および哺育期間では,対照群と被験物質投与群との間に差は認められなかった.

4) 血液学検査(Table 1)

 8 mg/kg 以上の投与群で対照群に比べ赤血球数の低値がみられ,さらに40および 200 mg/kg群でヘマトクリット値およびヘモグロビン量の低値,網赤血球比率の高値が認められた.200 mg/kg 群で血小板数の僅かな高値が認められたが,いずれも対照群の変動の範囲内(対照群の 2標準偏差の範囲)であった.その他,8 mg/kg 群で好酸球比率の高値,40 mg/kg群で好中球比率の高値およびリンパ球比率の低値が認められたが,いずれも用量に関連した変化ではなかった.

5) 血液生化学検査(Table 2)

 40および 200 mg/kg群で対照群に比べ総蛋白,アルブミンおよびγ-GTP活性の高値,クレアチニンの低値が認められ,さらに 200 mg/kg群で A/Gおよび総ビリルビンの高値が認められた.その他,8 mg/kg 群で塩素の高値および無機リンの低値,40 mg/kg群で尿素窒素の僅かな高値,200 mg/kg 群で塩素の低値が認められたが,いずれも用量に関連した変化ではなかった.

6) 器官重量(Table 3,4)

 雄では,200 mg/kg 群で対照群に比べ肝臓,腎臓の実重量および相対重量がともに高値を示した.8 および 40 mg/kg 群では,対照群と比べて差はなかった.雌では,200 mg/kg 群で対照群に比べ肝臓の相対重量が高値を示し,実重量も高値傾向を示した.また,同群で対照群に比べ腎臓の実重量および相対重量が高値傾向を示したが,統計学的有意差は認められなかった.8 および 40 mg/kg 群では,対照群と比べて差はなかった.

7) 剖検所見

 死亡例は,雄の対照群および雌の200 mg/kg群で各 1例であり,雄では肺の赤色化が,雌では脾臓の褐色化,胸腺の萎縮,肺の赤色化および胃の白色斑/区域が観察された.妊娠を成立させた雄では,肝臓および腎臓の肥大が 200 mg/kg群で 4および 3例に,肝臓の黄色化が 8 mg/kg群で 2例に観察された.哺育4日の母動物では,胸腺の萎縮が8 および 40 mg/kg 群で 2および 1例,肝臓の肥大が 200 mg/kg群で 4例,副腎の肥大が 40 および 200 mg/kg群で 2および 1例に観察された.

 交尾不成立の動物は,雄の対照群および 40 mg/kg 群で各 1例,雌の対照群および 40mg/kg群で各1 例であり,雄では精巣および精巣上体の萎縮が 40 mg/kg 群の 1例に観察された.雌では異常所見は観察されなかった.

 死産児のみを娩出した雌および哺育 4日までに全児死亡が認められた雌は 200 mg/kg群で 5例であり,肝臓の肥大が 2例,胸腺の萎縮,肺の赤色斑/区域,胃の潰瘍および白色斑/区域,小腸の潰瘍,大腸の白色斑/区域,肝臓の淡明化,腎臓の黒色化および瘢痕,卵巣の嚢胞,副腎の肥大が単発性に観察された.

 その他、妊娠を成立させた雄および哺育 4日の母動物で観察された所見は、発現率も低く投与に関連する変化とは考えられなかった。

8) 病理組織学検査(Table 5,6)

 死亡例は雄の対照群および雌の200 mg/kg群で各 1例であり,雄では肺の浮腫およびうっ血が観察された.雌では胸腺の萎縮,胃の潰瘍,肝臓の単細胞壊死および乳腺の増生が観察された.

 妊娠を成立させた雄では,脾臓の中等度の色素沈着が200 mg/kg 群で12例中10例に観察され,肝臓では細胞分裂像が8 および200 mg/kg 群でそれぞれ 1および 5例に,単細胞壊死が 200 mg/kg群で 7例に,また,肝細胞腫脹が 200 mg/kg群で 2例に観察された.腎臓では硝子滴変性が 200 mg/kg群で 6例に観察された.その他認められた所見は,対照群と被験物質投与群との間で発現数の差はなかった.

 哺育 4日の母動物では,肝臓の単細胞壊死および肝細胞腫脹が 200mg/kg 群でそれぞれ 4および 5例に観察された.腎臓では好塩基性化が 200 mg/kg 群で 5例に,空胞化が 8 mg/kg以上の投与群で 2から 4例に,細胞分裂像は 40 および 200 mg/kg群でそれぞれ 1例に,また,壊死が 40 および 200 mg/kg群でそれぞれ 1および 2例に観察された.その他認められた所見は,対照群と被験物質投与群との間で発現数の差はなかった.

 交尾不成立の動物は雄の対照群および 40 mg/kg 群で各 1例,雌の対照群および 40 mg/kg 群で各 1例であり,雄では脾臓の中等度の色素沈着,肝臓の細胞浸潤,精巣および精巣上体の萎縮が 40mg/kg 群で,前立腺の細胞浸潤が対照群で,また,副腎の空胞化が対照群および 40 mg/kg 群で観察された.雌では肝臓の細胞浸潤,腎臓の好塩基性化および子宮の細胞浸潤が 40 mg/kg 群で,脾臓の中等度の色素沈着が対照群および 40 mg/kg 群で観察された.

 死産児のみを娩出した雌および全児死亡の認められた雌は200 mg/kg 群で5例であり,脾臓の中等度の色素沈着,胸腺の萎縮および乳腺の増生が全例に観察された.その他,胃,十二指腸および大腸の潰瘍が単発性または少数例に,肝臓では肝細胞腫脹が 4例に,変性,壊死および単細胞壊死が単発性に観察された.腎臓では壊死,蛋白様円柱,好塩基性化,硝子滴変性,細胞分裂像,尿細管腔の拡張,空胞化および線維化が単発性または少数例に観察された.また,副腎の硬塞が少数例に観察された.

9) 精細管の精上皮細胞の観察

 2,4-ジクロロニトロベンゼンによる投与45日の精巣において,200 mg/kg 投与群のステージVIIIの精祖細胞,プレレプトテン期精母細胞,パキテン期精母細胞,ステップ 8精子細胞およびセルトリ細胞数は対照群に比較して統計学的に有意な差は認められなかった.

2. 生殖発生毒性

1) 交尾および受胎能(Table 7)

 交尾は対照群および 40 mg/kg 群で各 1組が不成立であり,8 および 200 mg/kg群は全例成立した.対照群および40 mg/kg 群の交尾不成立の雌は交配期間を通じ偽妊娠(連続した発情休止期像)が認められ交尾成立まで至らなかった.各群の交尾率は91.7〜100 %であり,群間差は認められなかった.受胎はすべての群で全例成立した.性周期観察では,いずれの群もほぼ4〜5日の性周期を示し,平均性周期に群間差は認められなかった.200 mg/kg 群で交配前期間に偽妊娠(連続した発情休止期像)が 1例に認められたが,交配期間中は正常な性周期を示した.

2) 分娩および哺育(Table 8)

 妊娠期間は各群で平均22.5〜22.7日の範囲であり,分娩時間の延長も認められなかった.200 mg/kg群で 9匹の新生児を娩出し分娩中に死亡した動物が 1例観察され,剖検時の子宮内検査において子宮内および腟内に残留胎児が 8匹確認された.また,同群で死産児のみを娩出した動物が 2例,哺育期間中に全児死亡の認められた動物が 3例観察され,対照群に比べ出産生児数(総出産生児数,雌の出産生児数)の減少,出生率および雌の哺育 4日生存率の低値,分娩率,雄の出産生児数および哺育 4日生存率の低値傾向ならびに死産児数の増加傾向がみられた.対照群,8 および 40 mg/kg 群では,分娩状態の異常は観察されず,黄体数,着床痕数,性比,出産率,着床率,分娩率,出生率および新生児の哺育 4日生存率に群間差は認められなかった.

3) 新生児の形態,体重および剖検所見

 新生児の外表検査では,外傷(腹部)が 8 mg/kg群で 1例,皮下出血(後肢,鼻部)が8 および 200 mg/kg 群で各 1例に観察されたのみでその他異常は観察されなかった.哺育期間中の体重は,雌雄ともに群間差は認められなかった.死亡児の剖検では,胸腺の頸部残留が対照群,8 および 200 mg/kg 群で散見されたのみであった.哺育 4日の剖検では,胸腺の頸部残留,肝臓の白色斑/区域および腎盂拡大が対照群,8 および 40 mg/kg 群で散見された.

考察

1.反復投与毒性

 死亡例は雄の対照群および雌の 200 mg/kg群で各 1例観察された.このうち雄は投与 4週に死亡し,剖検で肺の赤色化,病理組織学検査で肺の浮腫およびうっ血が認められたことから,誤嚥による呼吸不全が死亡の原因と考えられ,被験物質投与による直接的影響ではないと判断した.雌については妊娠23日の分娩中に死亡し,病理組織学検査で肝臓の単細胞壊死および胃の潰瘍が観察されていることから,被験物質投与に起因する死亡と考えられた.また,先に実施した14日間反復投与による予備試験において,雌の 400 mg/kg群で 6例中 4例の死亡が観察されていることから,本試験における200 mg/kg/day は死亡を惹起する用量と考えられた.雌の 200 mg/kg群で妊娠期間中に体重増加抑制が認められたが,雄については投与期間を通じ被験物質投与の影響は認められなかった.摂餌量において,雄の 200 mg/kg群および雌のすべての被験物質投与群で増加したが,軽度で,かつ体重に一致しない変化であり,背景値と比べて差はないことから,被験物質投与による影響ではないと考えられた.

 血液学検査では,8 mg/kg 以上の投与群で赤血球数が低値を40および 200 mg/kg群でヘマトクリット値およびヘモグロビン量が低値を,網赤血球比率が高値を示し,軽微ながら貧血傾向が認められた.血液生化学検査では,40および 200 mg/kg群でγ-GTPが高値を,クレアチニンが低値を,さらに200mg/kg 群で総ビリルビンが高値を示し,肝臓に対する被験物質投与の影響が示唆された.また,40および 200 mg/kg群で総蛋白およびアルブミンが,さらに 200 mg/kg群で A/Gが高値を示した.

 器官重量は,雄の 200 mg/kg群で肝臓,腎臓の実重量および相対重量がともに増加し,雌についても同群で肝臓,腎臓の実重量および相対重量が増加または増加傾向を示した.肝臓および腎臓重量の増加に関連する剖検所見として,雌雄の 200 mg/kg群で肝臓の肥大が,雄の 200 mg/kg 群で腎臓の肥大が観察された.その他,被験物質投与に起因すると考えられる所見として,胸腺の萎縮または副腎の肥大が雌の被験物質投与群で観察された.肝臓の黄色化が雄の 8 mg/kg群で 2例に観察されたが被験物質投与との関連は明らかでなかった.組織学的には,肝臓に肝細胞腫脹および単細胞壊死が観察された.核分裂像は雄の 200 mg/kg 群に多く観察され,これらの所見は剖検所見で指摘された肝臓の肥大を裏付ける変化と考えられた.腎臓では,雄に尿細管上皮の硝子滴変性,雌に好塩基性化がいずれも 200 mg/kg 群にやや多く観察された.肝臓および腎臓に観察されたこれらの病変はいずれも被験物質投与に起因するものと考えられた.さらに雌では少数例ではあるが,尿細管上皮の壊死が 40および 200 mg/kg群にそれぞれ 1および 2例観察され,細胞分裂を伴うものであった.また,空胞化は 8 mg/kg以上の投与群に観察されており,被験物質投与の影響に性差のあることが示唆され,雌では妊娠状態における要因も関与していることが考えられる.200 mg/kg 群において死産児のみを娩出した雌および全児死亡の認められた雌では,脾臓の中等度の色素沈着,胸腺の萎縮,肝細胞腫脹が4〜5例に,胃,十二指腸および大腸の潰瘍,肝臓の変性・壊死および単細胞壊死,腎臓の尿細管上皮の壊死,好塩基性化,蛋白様円柱,硝子滴変性,細胞分裂像,尿細管腔の拡張,空胞化および線維化など多彩な病変が少数例に観察された.いずれも被験物質投与の影響に加え,妊娠の関与が示唆された.なお,類似物質であるニトロベンゼンやジニトロベンゼンにおいて,精細管上皮のセルトリ細胞に直接障害を及ぼすことが報告されているため,対照群の10例および 200 mg/kg群の12例について精巣のHEおよび PAS染色標本を作製し,ステージVIIIの精細管の精上皮細胞数を測定した結果,精祖細胞,プレレプトテン期精母細胞,パキテン期精母細胞,ステップ 8精子細胞およびセルトリ細胞数は対照群と比較して差はなく,精巣毒性は認められなかった.

 以上のことから,2,4-ジクロロニトロベンゼンの反復投与により,雌の 200 mg/kg群で体重増加抑制が,雄の40および 200 mg/kg群で貧血傾向,総蛋白,アルブミンおよびγ-GTPの高値およびクレアチニンの低値,さらに 200 mg/kg群で総ビリルビンおよび A/Gの高値,肝臓および腎臓重量の増加,肝臓または腎臓の肥大が認められた.病理組織学検査では,雄の200 mg/kg群および雌の8 mg/kg以上の投与群で肝臓および腎臓を中心とした異常所見が認められ,本剤における標的器官は肝臓および腎臓と考えられた.従って,無影響量は雌雄ともに 8 mg/kg/day未満と判断される.

2. 生殖発生毒性

 交尾能および受胎能に被験物質投与の影響は認められず,性周期についても,すべての投与群でほぼ4〜5日の周期を示し,被験物質投与の影響は認められなかった.交尾不成立の動物は対照群および 40 mg/kg 群で雌雄各 1例観察され,剖検の結果,40 mg/kg群の雄 1例に精巣および精巣上体の萎縮が認められた.本所見は交尾不成立の原因に関連すると考えられるが,被験物質投与との関連は明らかでなかった.

 分娩時観察では,200 mg/kg 群で一部の新生児を娩出した後に死亡した動物が 1例観察された.また,200 mg/kg 群で死産児のみを娩出した動物が 2例および哺育期間中に全児死亡の認められた動物が 3例観察され,出産生児数の減少,出生率,新生児の哺育 4日生存率および分娩率の低値または低値傾向ならび死産児数の増加傾向が認められたことから,分娩あるいは哺育機能の障害を惹起する可能性が示唆された.なお,妊娠期間および分娩時間では被験物質投与による影響は認められなかった.

 新生児の外表検査で認められた異常はいずれも単発性であり,自然発生性の所見と考えられた.また,新生児の体重も哺育 4日まで順調に増加し,死産児,死亡児および哺育 4日の剖検でも被験物質投与による影響は認められなかった.

 以上のことから,2,4-ジクロロニトロベンゼン による雄の生殖に及ぼす影響は,200 mg/kg/day 投与によっても認められず,無影響量は 200 mg/kg/dayと判断される.雌の生殖に及ぼす影響および児動物の発生・発育に及ぼす影響は,200 mg/kg 群で死産児のみを娩出した雌および哺育期間中の全児死亡が認められたことから,無影響量は 40 mg/kg/day と判断される.

文献

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連絡先
試験責任者:萩田孝一
試験担当者:田中亮太,渡 修明,
庄子明徳,廣内康彦,
小林和雄
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Correspondence
Authors:Koichi Hagita(Study director),
Ryota Tanaka, Nobuaki Watari,
Akinori Shoji,Yasuhiko Hirouchi,
Kazuo Kobayashi
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Pesticides(An-pyo Center), Japan 582-2 Shioshinden
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