n−ヘキサデカンのラットにおける
28日間経口投与および14日間回復による反復投与毒性試験

Repeated Dose Toxicity Study of n-Hexadecane by Oral Administration for 28 Days and Recovery for 14 Days to Rats

要約

n−ヘキサデカンを雌雄ラットに1日1回、28日間連続して経口投与し、その毒性について検討した。また、一部の動物については14日間の回復期間を設けた。投与量は、8、40、200および1000 mg/kgとし、対照として媒体のコーンオイル投与群を設けた。

1. 一般状態:死亡例はなく、異常症状は観察されなかった。
2. 体重:各投与群とも対照群とほぼ同様の推移を示した。
3. 摂餌量、摂水量、尿検査:被験物質の投与に起因すると思われる変動はみられなかった。
4. 血液学的検査:1000 mg/kg群の雄でプロトロンビン時間が有意な延長を、200および1000 mg/kg群の雌で赤血球数が有意な低値を、1000 mg/kg群の雌で平均赤血球色素量が有意な高値を示したが、いずれも回復期間終了時には消失した。
5. 血液化学的検査:1000 mg/kg群の雌雄でGPTが有意な高値を示したが、回復期間終了時には消失した。
6. 剖検所見:被験物質の投与に起因すると思われる変化はみられなかった。
7. 器官重量:絶対重量および相対重量がともに有意差を示す器官は認められなかった。
8. 病理組織学的検査:被験物質の投与に起因すると思われる組織変化は認められなかった。

以上の如く、n−ヘキサデカンの28日間経口投与により、200 mg/kg以上の雌で赤血球数の低値が、1000 mg/kgの雄でプロトロンビン時間の延長および雌雄でGPTの高値が認められた。しかしながら、これらの変動は14日間の回復期間後には消失する可逆性変化であった。したがって、当試験条件下におけるn−ヘキサデカンの毒性学的無影響量は、雌で40 mg/kg、雄で200 mg/kgと推測された。

緒言

既存化学物質の毒性学的性質を評価するために、化審法スクリーニング毒性試験のほ乳類を用いる28日間の反復投与毒性試験に基づき、n−ヘキサデカンを雌雄ラットに1日1回、28日間連続して経口投与し、さらに一部の動物については14日間の回復期間を設けた反復投与試験を実施した。

方法

1. 被験物質および媒体

被験物質のn−ヘキサデカン(CAS No.544-76-3)は、凝固点18.3℃、沸点287℃、比重0.7750の無色透明な液体である(Lot No.FAZ02、東京化成工業株式会社、純度99.8%)。なお、投与終了後に残余被験物質の一部を販売元に送付して分析した結果、純度は規格値に適合しており、保管期間中の安定性が確認された。

媒体として、コーンオイルを用いた。

2. 投与検体および濃度確認

被験物質を秤取し、コーンオイルに溶解して必要濃度の投与検体液を調製した。なお、被験物質は純度換算しないで、投与量は原体重量で表示した。

コーンオイル中の20および0.2%のn−ヘキサデカンは、室温・暗所保管で調製後10日間までの安定性が確認された。そこで、20、4および0.8%投与検体は調製後1日分ずつ分割して室温・遮光・気密下で保存し、1週間以内に使用した。また、0.16%投与検体液は用時調製した。

投与開始前および投与終了前の2回、調製検体液を財団法人日本食品分析センター名古屋支所に送付し、ガスクロマトグラフィーにより被験物質濃度を測定した。その結果、被験物質濃度は適正範囲内の値を示した。

3. 試験動物および飼育方法

(1) 試験動物

試験には毒性試験に一般的に用いられている動物種で、その系統維持が明らかであり、集積データも揃っているSprague-Dawley系雌雄ラット[Crj:CD (SD)]を用いた。動物は、日本チャールス・リバー株式会社から4週齢の雄および3週齢の雌をそれぞれ73匹ずつを購入した。入手後2日の体重範囲は、雄が73〜92 g、雌が48〜61 gであった。

(2) 検疫・馴化、群分け法および個体識別法

入手した動物は、5日間の検疫期間およびその後、雄は9日間、雌は16日間の馴化期間を設け、一般状態および体重推移に異常の認められない約6週齢の動物を群分けして試験に用いた。

体重を層別に分けた後、無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように、投与開始の前日に群分けした。一群の動物数は、雌雄各10あるいは15匹ずつとした。なお、動物の体重の変動範囲は平均値から±20%を越えないことを確認した。

検疫・馴化期間中の動物は入手日に油性インクならびに色素による染毛法により、群分け後の動物は色素による染毛法および耳パンチ法を併用して識別した。

(3) 動物飼育環境

動物は、室温20〜24℃、湿度40〜70%、明暗各12時間、換気回数12回/時に設定した動物飼育室で飼育した。

動物飼育ケージは、検疫・馴化期間中はステンレス製懸垂式ケージ(W:240×D:380×H:200 mm)を用いて1ケージあたり5匹までの群飼育とし、群分け後にはステンレス製五連ケージ(W:755×D:210×H:170 mm)を用いて個別飼育した。ステンレス製懸垂式ケージおよびステンレス製五連ケージの受け皿交換、給水瓶交換は1週間に2回以上、ステンレス製懸垂式ケージの交換およびステンレス製五連ケージの交換(給餌器とも)は2週間に1回以上行った。

(4) 飼料および飲料水

飼料は固型飼料(CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社)を給餌器に入れ、自由に摂取させた。なお、剖検日前日の午後3〜4時からは絶食とした。

飲料水は、水道水を給水瓶を用いて自由に摂取させた。

飼料中の微量金属および汚染物質の分析ならびに飲料水の水質検査の結果、いずれも検査結果は試験施設で定めた基準値の範囲内であった。

4. 投与経路、投与方法および群構成

(1) 投与経路およびその選択理由

n−ヘキサデカンは継続して経口的に人に摂取される可能性が考えられるため、当試験の投与経路は経口投与とした。

(2) 投与方法

金属製経口胃ゾンデを取り付けたプラスチック製ディスポーザブル注射筒を用いて、強制経口投与した。

投与液量は投与日あるいは投与日に最も近い測定日の体重を基準とし、5 ml/kg体重で算出した。投与開始時の体重範囲は、雄が181〜213 g、雌が144〜178 gであった。

投与期間は、化審法のスクリーニング毒性試験法に準じて1日1回で28日間反復投与とした。また、28日間投与後に一部の動物について14日間の回復期間を設けた。

(3) 群構成および投与量

群構成は、上記の如くとした。

*:投与期間終了時剖検例数
#:回復期間終了時剖検例数

(4) 投与量設定の理由

雄ラットを用いた予備試験(投与段階:0、62.5、125、250、500および1000 mg/kg)の結果、最高用量の1000 mg/kg群で一般状態の異常は観察されなかった。また、体重推移および剖検でも異常はみられなかった。そこで、当試験の投与量は化審法スクリーニング毒性試験法で限界用量とされている1000 mg/kgを最高用量とし、以下公比5により200、40および8 mg/kg群を設定した。なお、対照として被験物質と同一液量の媒体(コーンオイル)を投与する群を設けた。

5. 観察および検査項目

(1) 一般状態

一般状態および死亡の有無を、投与期間中は投与前・後の1日2回(ただし、剖検日は1回のみ)ならびに回復間間中は毎日1回観察した。

(2) 体重測定

投与期間中および回復期間中とも1週間に2回測定した。

(3) 摂餌量測定

投与期間中および回復期間中ともに連続2日間量を測定して1日量を算出し、1週間に1回測定した。

(4) 摂水量測定

摂餌量測定と同様にして摂水量を測定した。

(5) 尿検査

投与期間終了前に投与期間終了時の剖検用動物を、また回復期間終了前に回復期間終了時の剖検用動物について実施した。すなわち、採尿ケージを用いて絶食・給水下で3時間で採取した尿(3時間尿)と引き続いて給餌・給水下で21時間で採取した尿(21時間尿、合計24時間尿)について、以下の検査を実施した。

3時間尿:色調は、外観判定とした。pH、潜血、蛋白、糖、ケトン体、ウロビリノーゲン、ビリルビンは、エームスクリニテック用検査紙(マイルス・三共株式会社)に尿を滴下後に、エームス尿分析器(クリニテック200、エームス)を用いて検査した。尿沈渣は、沈渣を尿沈渣染色液で染色後に顕微鏡下で観察した。なお、3時間(投与期間中は当日の検体投与後、ほぼ午前10時〜午後1時)で所定量の採尿ができない場合には、翌日に採尿して検査した。

21時間尿:比重を、屈折型比重計(ユリペット、日本光学工業株式会社)を用いて測定した。

24時間尿:尿量を重量により測定した。

(6) 血液学的検査

最終投与の翌日および回復期間終了後に、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で、腹大動脈からカニュレーションにより血液を採取し、以下の血液学的検査を実施した。

プロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)は、3.13%クエン酸ナトリウムで処理した血漿について、散乱光検出方式によりコアグマスター供併斡Τ式会社)を用いて測定した。

赤血球数(RBC)、白血球数(WBC)、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値および血小板数は、EDTA-2KコーティングしたSysmexサンプルカップに採取した血液について、Sysmex多項目自動血球計数装置(E-2000、東亜医用電子株式会社)を用いて測定した。さらに、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球血色素量(MCH)、平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した。

網状赤血球数(Ret)は、EDTA-2K処理した血液をBrecher法により超生体染色してスライドグラスに塗抹後、Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で赤血球1000個中の数を計数した。

白血球百分率は、EDTA-2K処理した血液をスライドグラスに塗抹し、May-Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で白血球100個を分類計数した。

(7) 血液化学的検査

血液学的検査用の血液と同時期に採取した血液から得た血清について、以下の血液化学的検査を実施した。

GOTおよびGPTはHenry変法、ALPはρ-NPP基質法、γ-GTPはγ-G-P-NA基質法、総コレステロール(T-Cho)はCOD・DAOS法、トリグリセライド(TG)はGPO・DAOS法、総蛋白(TP)はBiuret法、尿素窒素(BUN)は酵素法、クレアチニンはJaff法、総ビリルビン(T-Bil)はAzobilirubin法、ブドウ糖(Glucose)はGlucose dehydrogenase法、Caはo-CPC法、無機リン(IP)はMolybdenum blue法により、自動分析装置(AU 500、オリンパス光学工業株式会社)を用いて測定した。

NaおよびKは、炎光光度法により炎光光度計(FLAME-30C、日本分光メディカル株式会社)を用いて測定した。

Clは、電量滴定法によりCHLOR METER(C-200AP、株式会社常光)を用いて測定した。

蛋白分画[アルブミン;α1-、α2-、α3-、β-、γ-グロブリン]は、自動電気泳動装置(AES 600、オリンパス光学工業株式会社)を用いて測定した。

A/G(アルブミン/グロブリン)比およびアルブミン量は、総蛋白量および蛋白分画値から算出した。

(8) 剖検

最終投与の翌日および回復期間終了後の剖検時に採血した動物について、放血致死後に、器官・組織の肉眼的観察を行った。

(9) 器官重量の測定

剖検後に、以下の器官重量を測定した(ただし、対器官は一括秤量)。さらに、剖検前に測定した体重を基準として、器官重量の体重比(相対重量)を算出した。

脳(大脳、小脳、延髄)、肝臓、腎臓、副腎、精巣または卵巣。

(10) 病理組織学的検査

以下の器官または組織を摘出して10%中性緩衝ホルマリン液(ただし、眼球はグルタールアルデヒド・ホルマリン液)で固定し、全例について常法に従ってパラフィン包埋標本を作製した。

心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、腎臓、膀胱、精巣、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、上皮小体、脳(大脳、小脳、延髄)、眼球、骨髄(大腿骨)。

投与期間終了時剖検例の対照群および最高用量(1000 mg/kg)群の心臓、肝臓、脾臓、腎臓および副腎についてHematoxylin-Eosin(H-E)染色組織標本を作製し、病理組織学的検査を行った。さらに、剖検時に異常が認められた200mb/kg 群の雄2例および1000mg/kg群の雌1例の胃(その対照となる対照群の雌雄各1例の胃を含む)のH-E染色組織標本を作製し、病理組織学的検査を行った。

6. 統計学的方法

測定値の統計学的方法は下記のように多重比較検定を行い、有意差検定は対照群とn−ヘキサデカンの各投与群との間で行った。いずれの検定においても、危険率5%未満を有意とし、5%未満(p<0.05)と1%未満(p<0.01)とに分けて表示した。

体重、摂餌量、摂水量、尿量、尿比重、血液学的検査、血液化学的検査、器官重量(相対重量を含む)については、各群で平均値および標準偏差を算出した。多重比較検定では、Bartlett法による等分散性の検定を行い、等分散ならば一元配置法による分散分析を行い、有意ならば対照群との群間比較はDunnett法(例数が等しい場合)またはScheff法(例数が等しくない場合)を用いて行った。一方、等分散と認められなかった場合は、順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallisの検定)を行い、有意ならば対照群との群間比較は順位を利用したDunnett法またはScheff法を用いて行った。

結果

1. 一般状態

対照群を含む各群の雌雄とも、投与期間および回復期間を通じて異常症状は観察されなかった。

2. 体重(Fig.1)

投与期間中は、各投与群の雌雄とも対照群とほぼ同様の推移を示し、有意差は認められなかった。

回復期間中は、雌雄とも1000 mg/kg群の体重が対照群に比してやや高値であったが、有意差は認められなかった。

3. 摂餌量(Fig.2)

投与期間中は、1000 mg/kg群の雌で対照群に比してやや高値であり、投与17日には有意差が認められた。その他には、各投与群の雄および200 mg/kg以下の投与群の雌の値は対照群とほぼ同程度であった。

回復期間中は、1000 mg/kg群の雄で対照群に比して高値であり、回復3日には有意差が認められた。1000 mg/kg群の雌は、対照群とほぼ同程度であった。

4. 摂水量(Fig. 3)

投与期間中は、各投与群の雌雄とも対照群とほぼ同程度であり、有意差は認められなかった。

回復期間中は、1000 mg/kg群の雌雄とも対照群に比して高値であり、回復3日の雄および回復10日の雌雄に有意差が認められた。

5. 尿検査

(1) 投与期間終了時

尿の定量および定性検査の結果、各投与群の雌雄とも対照群とほぼ同様であった。

(2) 回復期間終了時

対照群に比して、1000 mg/kg群の雄では尿量がやや多く、尿比重がやや低値であったが、有意差は認められなかった。

色調、pH、蛋白、糖、ケトン体、ビリルビン、潜血、ウロビリノーゲンおよび沈渣は、1000 mg/kg群の雌雄とも対照群とほぼ同様であった。

6. 血液学的検査(Table 1、2)

(1) 投与期間終了時

対照群に比して、1000 mg/kg群の雄でプロトロンビン時間が有意な延長を示した。また、200および1000 mg/kg群の雌で赤血球数が有意な低値を、さらに1000 mg/kg群の雌では平均赤血球血色素量が有意な高値を示した。その他の検査項目には、対照群との間に有意差は認められなかった。

(2) 回復期間終了時

投与期間終了時に認められたプロトロンビン時間、赤血球数および平均赤血球血色素量の有意差は消失した。また、1000 mg/kg群の雌雄でいずれの検査項目とも対照群との間に有意差は認められなかった。

7. 血液化学的検査(Table 3、4)

(1) 投与期間終了時

対照群に比して、1000 mg/kg群の雌雄でGPTが有意な高値を示した。また、1000 mg/kg群の雄でALPが有意な低値を示した。その他の検査項目には、対照群との間に有意差は認められなかった。

(2) 回復期間終了時

投与期間終了時に認められたGPTおよびALPの有意差は消失した。新たに、1000 mg/kg群の雄で総蛋白およびCaが、雌でβ-グロブリン分画およびクレアチニンが有意な低値を、雄でKが有意な高値を示した。

8. 剖検所見

(1) 投与期間終了時

胃(腺胃粘膜)の白色化が1000 mg/kg群の雌1例および200 mg/kg群の雄2例にみられた。胃の白色化は腺胃部分のほぼ全領域を占めたが、浮腫性ではなかった。また、脾臓・左卵巣・大網の癒着が40 mg/kg群の雌1例にみられた。その他には、著変はみられなかった。

(2) 回復期間終了時

精巣および精巣上体の小型化(両側)が対照群の1例にみられた。当変化は、色調および弾力性の変化を伴わなかった。その他には、著変はみられなかった。

9. 器官重量(Table 5、6)

(1) 投与期間終了時

腎臓絶対重量の有意な高値が1000 mg/kg群の雌で認められた。その他には、各投与群の雌雄で器官絶対重量および相対重量ともに対照群との間に有意差は認められなかった。

(2) 回復期間終了時

1000 mg/kg群の雌雄の各器官の絶対重量および相対重量ともに、対照群との間に有意差は認められなかった。

10. 病理組織学的検査

腎臓で、尿細管上皮のごく軽度の好塩基性化が対照群の雄1例および1000 mg/kg群の雄2例にみられた。雌の腎臓および雌雄の肝臓、心臓、脾臓ならびに副腎では、対照群および1000 mg/kg群でいずれも著変はみられなかった。剖検時に異常が認められた胃では、雌雄の各例とも著変はみられなかった。

考察

n−ヘキサデカンを雌雄ラットに8、40、200および1000 mg/kgの用量段階で1日1回、28日間連続して経口投与した反復投与毒性試験を実施した。また、対照群および1000 mg/kgには14日間の回復期間を設け、回復性について検討した。

投与期間終了時の検査で対照群に比して有意差が認められた変化は、血液学的検査におけるプロトロンビン時間の延長(1000 mg/kg群の雄)、赤血球数の低値(200 mg/kg以上の群の雌)、平均赤血球血色素量の高値(1000 mg/kg群の雌)、血液化学的検査におけるGPTの高値(1000 mg/kg群の雌雄)、ALPの低値(1000 mg/kg群の雄)および腎臓絶対重量の高値(1000 mg/kg群の雌)であった。

プロトロンビン時間の延長は、1000 mg/kg群の雄のみに認められた。しかしながら、変動幅はわずかであり、血小板数および活性化部分トロンボプラスチン時間には影響が認められず、また病理組織学的検査でも肝臓に著変はみられなかったことから、軽度の変化と思われた。一方、赤血球数の低値は200および1000 mg/kg群の雌に認められた。両群では、ヘモグロビン量およびヘマトクリット値も低値傾向を示したが、有意差は認められなかった。また、赤血球数の低値は網状赤血球数の高値を伴う程の変動ではなかったことから、当変動も軽度のものと思われた。平均赤血球血色素量の変動は、赤血球数およびヘモグロビン量の変動比率の違いに起因したものと考えられた。GPTの高値は、1000 mg/kg群の雌雄で認められた。しかしながら、GOTには変動はみられず、ALPは雄ではむしろ低値を示した。さらに、これらの検査値に関連すると思われる器官の肝臓には組織変化がみられないことから、軽度の機能的変動に留まるものと思われた。腎臓絶対重量の高値は1000 mg/kg群の雌に認められたが、相対重量には有意な変動はないこと、腎臓に特異的な組織変化がみられないことから、毒性を示唆する所見とは考え難かった。これらの変動は、いずれも14日間の回復期間後には消失する可逆性のものであった。

その他に、摂餌量では投与期間中に1000 mg/kg群の雌で、回復期間中に同群の雄で一過性に高値が認められたが、体重に影響を及ぼす程の変動ではなかった。摂水量では、回復期間中に1000 mg/kg群の雌雄で高値が認められたが、尿量などの尿検査、尿素窒素・クレアチニンなどの腎機能および腎臓の組織検査には影響はなく、毒性を示す所見とは思われなかった。また、回復期間終了時には1000 mg/kg群の雄で総蛋白、K、Caに、雌でβ-グロブリン分画およびクレアチニンに変動が認められたが、いずれも投与期間終了時には影響がみられないことから、毒性学的な意義のない変化と考えられた。剖検では、投与期間終了時に200 mg/kg以上の群の少数例に腺胃粘膜の白色化がみられたが、必ずしも用量依存性を示さず、浮腫性変化はなく、また病理組織学的検査で著変が認められないことから、被験物質の毒性を示唆する変化とは思われなかった。また、一般状態には異常はみられず、体重、尿検査、病理組織学的検査では被験物質投与に起因すると思われる変化は認められなかった。

以上の如く、n−ヘキサデカンの28日間経口投与により、200 mg/kg以上の雌で赤血球数の低値が、1000 mg/kgの雄でプロトロンビン時間の延長および雌雄でGPTの高値が認められた。しかしながら、これらの変動は14日間の回復期間後には消失する可逆性変化であった。したがって、当試験条件下におけるn−ヘキサデカンの毒性学的無影響量は、雌で40 mg/kg、雄で200 mg/kgと推測された。

連絡先:
試験責任者和田浩
(株)日本バイオリサーチセンター羽島研究所
〒501-64 岐阜県羽島市福寿町間島 6-104
Tel 0583-92-6222Fax 0583-92-1284

Correspondence:
Wada, Hiroshi
Nihon Bioresearch Inc., Hashima Laboratory, Japan
6-104 Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-62,
Japan
Tel 81-583-92-6222Fax 81-583-92-1284