2,4-ジニトロフェノールの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 2,4-Dinitrophenol on Bacteria

要約

2,4-ジニトロフェノールの遺伝子突然変異誘発性の有無を検討するため，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．

用量は，用量設定試験の結果から菌の生育阻害が認められる用量を最高用量とし，直接法の場合は，TA100，TA1535およびWP2 uvrAでは156〜5000 μg/plate，TA98およびTA1537では78.1〜2500 μg/plateの範囲(公比2)で，また，代謝活性化法の場合は，TA100，TA1535およびTA1537では78.1〜2500 μg/plate，TA98およびWP2 uvrAでは156〜5000 μg/plateの範囲(公比2)で設定した．

試験は2回実施した．その結果，1回目の試験においては，全ての菌株において代謝活性化の有無にかかわらず，復帰変異コロニー数の増加は認められなかったが，2回目の試験においては，直接法でのTA98で陰性対照値の2倍を超える復帰変異コロニー数の増加が認められた．菌の生育阻害については，直接法の場合，TA1537では1250 μg/plate以上，TA100およびTA1535では2500 μg/plate以上，TA98では2500 μg/plate，WP2 uvrAでは5000 μg/plateで認められた．代謝活性化法の場合は，TA100，TA1535およびTA1537では2500 μg/plate，TA98では2500 μg/plate以上，WP2 uvrAでは5000 μg/plateで認められた．

そこで，TA98について78.1〜2500 μg/plateの範囲で用量を設定し，直接法における確認試験を2回行った．その結果，2回の試験とも用量依存的な復帰変異コロニー数の増加傾向が認められ，陰性対照値の2倍近くの増加が認められた．菌の生育阻害は，2500 μg/plateで認められた．

以上の成績から，2,4-ジニトロフェノールは，細菌に対し遺伝子突然変異を誘発する疑いがあるもの(疑陽性)と結論した．

方法

1.　指標菌株

国立公衆衛生院地域環境衛生学部から1994年12月19日に分与を受けたS. typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)およびE. coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．各菌株は，超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その25 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated, Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37 ℃で12時間振盪培養した．培養後の懸濁菌液は濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1×109以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．

各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

2.　被験物質

2,4-ジニトロフェノール(ロット番号8835703，三井化学(株)(東京)提供)は，淡黄色固体で，水に難溶，酢酸エチル，アセトン，ピリジンに易溶，ジメチルスルホキシド(DMSO)，クロロホルム，ベンゼン，トルエン，アルカリ性水溶液に可溶，熱湯，エタノールに微溶であり，純度85.2 %(不純物として，2,6-ジニトロフェノール0.6 %，水13.5 %を含む)の物質である．被験物質は，冷暗所(4 ℃)で密栓保管した．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

3.　被験物質供試液の調製

溶媒にDMSO(和光純薬工業(株))を用い，被験物質を溶解して最高用量の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定の用量の供試液を調製した．供試液は用時調製し，調製の際には純度換算を行った．

4.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを使用した．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株))
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9-AA:9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.)

AF-2および2-AAはDMSO(和光純薬工業(株))に，NaN3および9-AAは蒸留水((株)大塚製薬工場)に溶解した．

5.　培地

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．
硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No. 1)15 g

2)　アメ`ノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6 w/v%寒天粉末(Difco Laboratories)および0.5 w/v%塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mM D-ビオチンおよび0.5 mM L-ヒスチジン水溶液，E. coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

6.　S9 mix

エームステスト用凍結S9 mix(キッコーマン(株))を購入し，製造後6ヶ月以内に使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

7.　試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

試験管に使用溶媒，被験物質供試液あるいは陽性対照物質溶液を0.1 mL入れ，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37 ℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45 ℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37 ℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，用量設定試験では各用量とも1枚，本試験では3枚を使用した．本試験は，同一用量を用いて2回行った．

8.　結果の判定

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数(平均値)が溶媒対照値の2倍以上を示し，用量依存性および結果の再現性が認められる場合を陽性とした．

但し，明確な用量依存性が認められない場合においても，陽性値を示す試験結果に再現性が認められれば陽性と判定することとした．

結果および考察

100〜5000 μg/plateの範囲で行った用量設定試験においては，直接法の場合TA98およびTA1537では2000 μg/plate以上，TA100，TA1535およびWP2 uvrAでは5000 μg/plateで菌の生育阻害が認められた．代謝活性化法の場合はTA100，TA1535およびTA1537では2000 μg/plate以上，TA98およびWP2 uvrAでは5000 μg/plateで菌の生育阻害が認められた．したがって，本試験における被験物質の用量は，直接法の場合，TA98 およびTA1537では78.1〜2500 μg/plate(公比2)，TA100，TA1535およびWP2 uvrAでは156〜5000 μg/plate(公比2)，代謝活性化法の場合はTA100，TA1535およびTA1537で78.1〜2500 μg/plate(公比2)，TA98およびWP2 uvrAでは156〜5000 μg/plate(公比2)のそれぞれ6用量とした．

試験を2回行った結果(Tables 1〜4)，1回目の試験においては，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株において復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えることはなかったが，2回目の試験においては，直接法でのTA98の625 μg/plateで溶媒対照値の2倍を越える復帰変異コロニー数の増加(2.3倍)が認められた．菌の生育阻害については直接法の場合，TA1537では1250 μg/plate以上，TA100およびTA1535では2500 μg/plate以上，TA98では2500 μg/plate，WP2 uvrAでは5000 μg/plateで認められた．代謝活性化法の場合はTA100，TA1535およびTA1537では2500 μg/plate，TA98では2500 μg/plate以上，WP2 uvrAでは5000 μg/plateで認められた．

そこで，TA98について本試験と同様の用量に496 μg/plate(313 μg/plateと625 μg/plateの中間量)と938 μg/plate(625 μg/plateと1250 μg/plateの中間量)を加えた計8用量を設定し，直接法における確認試験を2回行った．その結果(Tables 5〜6)，2回の試験とも，用量依存的な復帰変異コロニー数の増加傾向が認められ，溶媒対照値の2倍近くの増加(1回目:1.75倍，2回目:1.78倍)が認められた．菌の生育阻害は，2500 μg/plateで認められた．

以上の結果，2,4-ジニトロフェノールの遺伝子突然変異誘発性は陽性とは判定できないものの，TA98おいては用量依存的な復帰変異コロニー数の増加傾向に再現性が認められ，復帰変異コロニー数の最大値が溶媒対照値の1.3〜2.3倍に達したことから，本被験物質は遺伝子突然変異を誘発する可能性が高いものと考えられる．

したがって本実験条件下では，2,4-ジニトロフェノールは，遺伝子突然変異を誘発する疑いがあるもの(疑陽性)と判定した．

2,4-ジニトロフェノールの変異原性については，S. typhimuriumを用いた復帰変異試験およびシリアンハムスター由来のBHK21cl13細胞を用いたトランスフォーメーション試験でともに陰性3)との報告がある．

2,4-ジニトロフェノールの類縁化合物である2,4,6-トリニトロフェノール(picric acid)は，S. typhimuriumを用いた復帰変異試験でTA98およびTA1537において陽性4)と報告されているが，4-ニトロフェノール4)および2-ニトロフェノール4)では同様の試験で，また，3-メチル-4-ニトロフェノール5)ではE. coliを加えた同様の試験でいずれも陰性と報告されている．4-ニトロフェノールについては，初代ラット肝細胞を用いた不定期DNA合成試験で陰性6)，Proteus mirabilisを用いたDNA修復試験で陽性7)と報告されている．

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green, “Handbook of Mutagenicity Test Procedures,” 1, Vol. 3, eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.
3)I. F. H. Purchase, E. Longstaff, J. Ashby, J. A. Styles, D. Anderson, P.A .Lefevre, F. R. Westwood, Br. J. Cancer, 37, 924(1978).
4)S. Haworth, T. Lawlor, K. Mortelmans, W. Speck, E. Zeiger, Environ. Mutagen., 5, 3(1983).
5)高島浩介，鈴木文子，亀地礼子，川上久美子，松木容彦，北嶋美似子，化学物質毒性試験報告，2, 163(1995).
6)G. S. Probst, R. E. McMahon, L. E. Holl, C. Z. Thompson, J. K. Epp, S. B. Neal, Environ. Mutagen., 3, 11(1981).
7)B. Adler, R. Braun, J. Schoneich, H. Bohme, Biol. Zbl., 95, 463(1976).

連絡先
試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology 3-7-11
Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132 Japan
Tel +81-42-762-2775Fax +81-42-762-7979