(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドのラットを用いる
28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test
of (Methacryloyloxyethyl)trimethylammonium chloride in Rats

要約

(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドの28日間反復経口投与毒性試験(回復14日間)を雌雄のSprague-Dawley系ラットを用いて実施した.第一期試験の投与量は,雌雄とも0(対照群),50,150および500 mg/kgとした.その結果,被験物質の毒性を明らかにすることができなかったため,「化審法毒性試験法,スクリーニング毒性試験−ほ乳類を用いる28日間の反復投与毒性試験−」の最高限度用量である1000 mg/kgを投与する追加試験を実施した.追加試験の群構成は,雌雄とも媒体である注射用水を投与する対照群と1000 mg/kg投与群の2群とした.

その結果,1000 mg/kg投与群の一部の例では,投与期間中,一過性に排便量の減少がみられ,この症状にほぼ一致して軽度な体重減少あるいは増加抑制が認められた.また,投与期間中の対照群と1000 mg/kg投与群の平均体重には有意な差はみられなかったが,1000 mg/kg投与群の雄では投与期間終了時の解剖時体重が有意な低値を示した.さらに,雌では投与第1週および2週,雄では投与第2週および3週の摂餌量がそれぞれ対照群と比較して有意な低値を示した.一方,尿検査,血液学検査,血液生化学検査および器官重量を含む病理学検査では,いずれも被験物質投与に起因したと考えられる変化は認められなかった.

以上のように,(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドを1000 mg/kgの用量で反復投与することにより,雌雄とも一部の例で投与期間中一過性に排便量の減少,軽度な体重の増加抑制がみられたが,これら以外には生体の機能および形態の明らかな変化はなく,毒性影響は認められなかった.したがって,本試験条件下における(メタクリロイルオキシエチル) トリメチルアンモニウムクロリドの無影響量は,雌雄とも1000 mg/kg/dayであると判断された.

方法

1. 被験物質

被験物質として,三菱ガス化学(株)(新潟)より提供された(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドの78.1 %水溶液(ロット番号:CA81012)を用いた.提供された水溶液は無色透明の液体で,安定剤として4-メトキシフェノールを1962 ppm含有していた.被験物質は,密閉,冷蔵,遮光下で保管した.なお,被験物質の試験期間中の安定性は,残余被験物質を提供元で再分析することにより確認した.

投与検体は,被験物質を局方注射用水(製造番号:9707SA,光製薬(株))で希釈して(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリド濃度として10または20 w/v%溶液を調製し,これを注射用水により各濃度に段階希釈した.なお,調製した各濃度の投与検体の含量測定を実施した結果,溶液中の被験物質の平均含量は,所定濃度の97.0〜101 %であった.また,動物試験に先立って,被験物質の1および20 w/v%溶液の安定性を調べたところ,調製後,冷蔵,遮光条件下で8日間は安定であることが確認されたため,投与検体は1週に1回の割合で調製し,使用時まで冷蔵,遮光条件下で保管した.

2. 動物および飼育方法

試験には,生後4週で購入し,検疫を兼ねて8日間予備飼育した雌雄のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD(SD)IGS,日本チャールス・リバー(株))各50匹を使用した.

群分けは,各試験とも検疫期間中に異常がなかった動物を用い,投与開始前日の体重に基づいて体重別層化無作為抽出法により行った.動物数は,第一期試験では雌雄とも対照群および500 mg/kg投与群を各10匹とし,50および150 mg/kg投与群を各5匹とした.また,追加試験では,雌雄の対照群および1000 mg/kg投与群とも各10匹とした.

動物は,温度24 ± 1 ℃,湿度50〜65 %,換気回数約15回/時,照明12時間(7〜19時点灯)に設定した飼育室内で,金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し,固型飼料(CE-2,日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水) を自由摂取させて飼育した.

3. 投与量の設定および投与方法

第一期試験の投与量は,投与量設定のための予備試験の結果に基づき決定した.すなわち,(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドを0,250,500 および1000 mg/kgの用量で,7日間反復投与することにより,雌では500 mg/kg以上の投与群で体重の増加抑制傾向がみられ,さらに,1000 mg/kg投与群では,剖検時に肺の暗色部が認められた.また,雄の500 mg/kg 投与群では,投与期間中に一時的な体重減少がみられる例があった.以上のことから,本試験では投与期間を考慮し,高用量を500 mg/kgとし,以下公比約3で除して150および50 mg/kgを中用量および低用量とした.この他,雌雄とも媒体である注射用水を投与する対照群を設けた.

また,追加試験では,第一期試験で高用量群として設定した500 mg/kg投与群でも被験物質の毒性を明らかにすることができなかったため,「化審法毒性試験法,スクリーニング毒性試験−ほ乳類を用いる28日間の反復投与毒性試験−」の最高限度用量である1000 mg/kgを高用量とし,他に媒体を投与する対照群を設けた.

投与経路は強制経口投与とし,1日1回,28日間,ラット用胃管を用いて投与した.投与容量は5 mL/kgとし,投与液量は雌雄とも最近時の体重をもとに個体別に算出した.なお,回復期間はいずれの試験も14日間とした.

4. 観察および検査

1) 一般検査

毎日(投与期間中は投与前および投与後)全例の一般状態を観察した.また,体重は,投与第1週に投与第1日の投与直前と5日,投与第2週以降回復期間終了週までは1週に2回の頻度で測定し,その他,投与期間終了日,回復期間終了日および剖検日にも測定した.摂餌量は,投与第1週では,投与第1日から2日にかけて1日あたりの摂餌量を測定し,以後回復期間終了週まで毎週1回の頻度で測定した.

2) 尿検査

各群とも全例について,投与第4週および回復第2週に代謝ケージに収容して蓄尿し,約4時間の時点で採尿した.この4時間尿を用いて,pH,潜血,蛋白,糖,ケトン体,ビリルビン,ウロビリノーゲンを試験紙法(クリニテック200+,バイエル・三共(株))により,また色調および濁度を視診により検査した.

3) 血液学検査

投与期間ないし回復期間終了日から翌日の剖検日にかけて定期解剖例全例を18から24時間絶食させ,ペントバルビタールナトリウム麻酔下で腹部後大静脈よりEDTA 2Kを抗凝固剤として採血し,Coulter Counter Model S-PLUS(コールターエレクトロニクス(株))により赤血球数,白血球数,平均赤血球容積,血小板数(以上,電気抵抗法)および血色素量(吸光度法)を測定し,これらを基にヘマトクリット値,平均赤血球血色素量および平均赤血球血色素濃度を算出した.血液の一部は塗抹標本とし,白血球分類(Wright-Giemsa染色)および網状赤血球比率(Brecher法)を求めた.また,クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採取した血液をCA-1000(東亜医用電子(株))によりプロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間(光散乱検出法)を測定した.

4) 血液生化学検査

血液学検査用の採血に引き続き,ヘパリンを抗凝固剤として採血し,血漿を分離して遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA,ロシュ・ダイアグノスティックス(株))により,総蛋白濃度(ビウレット法),アルブミン濃度(BCG法),総コレステロール濃度(COD・DAOS法),ブドウ糖濃度(グルコキナーゼ・G6PDH法),尿素窒素濃度(ウレアーゼ・Gl.DH法),クレアチニン濃度(Jaff法),アルカリフォスファターゼ活性(GSCC法),GOT活性(IFCC法),GPT活性(IFCC法),γ-GTP活性(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法),トリグリセライド濃度(GPO・DAOS法),無機リン濃度(モリブデン酸直接法),カルシウム濃度(OCPC法)を測定し,A/G比を算出した.また,全自動電解質分析装置(EA05,(株)A&T)により,ナトリウム濃度,カリウム濃度および塩素濃度(イオン電極法)を測定した.

5) 病理学検査

上記の採血に引き続き,動物を放血屠殺したのち,器官および組織の肉眼的観察を行った.また,各動物の脳,胸腺,心臓,肺,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,卵巣または精巣,精巣上体の重量測定を行い,各器官重量を剖検日の体重で除して,それぞれの相対重量を算出した.さらに,脳,下垂体,脊髄,眼球,甲状腺,上皮小体,心臓,気管,気管支,肺,肝臓,腎臓,胸腺,脾臓,副腎,胃,十二指腸,空腸,回腸,盲腸,結腸,直腸,前立腺,精嚢,卵巣,子宮,腟,乳腺,膀胱,下顎リンパ節,腸間膜リンパ節,骨格筋(下腿部),坐骨神経,大腿骨骨髄,膵臓,顎下腺,舌下腺,舌,食道,大動脈,ハーダー腺,皮膚を0.1 mol/Lリン酸緩衝10 vol%ホルマリン溶液(pH 7.2)に固定し,精巣,精巣上体はブアン液に固定した.心臓,肺,気管,気管支,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,精巣,精巣上体,卵巣はパラフィン包埋後,ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し,対照群および高用量群について病理組織学検査を実施した.

5. 統計解析

体重,摂餌量および定期解剖例の血液学検査,血液生化学検査ならびに器官重量について,群ごとに平均値および標準偏差を求めた.また,試験群が3群以上の場合は,Dunnett法で多重比較を行い,2群の場合には,Studentのt検定ないしAspin-Welchのt検定を行った.さらに,病理組織学検査所見は,グレード分けしたデータについてMann-WhitneyのU検定を,陽性グレードの合計値についてFisher直接確率の片側検定を行った.なお,これら対照群および被験物質投与群との間の有意差検定はいずれの場合も有意水準を5 %とした.

結果

1. 一般状態

第一期試験では,投与期間および回復期間中に死亡例はなく,また,いずれの例にも一般状態の変化は認められなかった.追加試験の1000 mg/kg投与群では排便量の減少が,投与第5日に雌雄各1例,投与第21から24日に雌1例に認められたが,いずれも一過性の変化であった.また,対照群の雄1例では痂皮が投与第26日以降に観察された.この他には,雌雄いずれの例にも投与期間および回復期間中に一般状態の変化は認められなかった.また,観察期間中の死亡例もなかった.

2. 体重(Fig. 1, 2)

第一期試験の500 mg/kg投与群では,雌雄とも投与第5日の体重が低値を示す傾向にあったが,その後の体重の推移には異常はみられず,他の被験物質投与群においても対照群と比較して有意な差は認められなかった.追加試験では,雌雄とも対照群と1000 mg/kg投与群との間に体重の有意な差はみられなかったが,1000 mg/kg投与群では,主に前述の排便量の減少がみられた例で,投与期間中に一過性の軽度な体重減少あるいは増加抑制が認められた.また,1000 mg/kg投与群の雄では,投与期間終了時の解剖時体重が有意な低値を示した.

3. 摂餌量(Fig. 3)

第一期試験の500 mg/kg投与群の雄では,投与第8日の摂餌量が対照群と比較して有意な低値を示したが,この他には,いずれの被験物質投与群においても有意な差は認められなかった.追加試験の1000 mg/kg投与群の雌では,投与第1週および2週,雄では投与第2週および3週の摂餌量がそれぞれ対照群と比較して有意な低値を示した.

4. 尿検査

第一期試験および追加試験とも,投与第4週および回復第2週日の尿検査では,いずれの検査項目においても,対照群と被験物質投与群の間に著しい差はみられなかった.

5. 血液学検査(Table 1)

第一期試験の投与期間終了時の検査では,50 mg/kg投与群の雌にヘマトクリット値の有意な増加がみられた以外,対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなかった.また,回復期間終了時の検査では,500 mg/kg投与群の雄に平均赤血球容積の有意な減少と平均赤血球血色素濃度の有意な上昇がみられ,雌では赤血球数の有意な減少が認められた.また,追加試験の投与期間終了時の検査では,1000 mg/kg投与群の雄に赤血球数の有意な増加および活性部分トロンボプラスチン時間の有意な延長がみられ,また,雌に平均赤血球容積の有意な減少および平均赤血球血色素濃度の有意な上昇が認められた.回復期間終了時の検査では,1000 mg/kg投与群の雌に白血球数の有意な減少が認められた.

6. 血液生化学検査(Table 2)

第一期試験の投与期間終了時の検査では,150 mg/kg投与群の雄にアルブミン濃度の有意な低下がみられ,A/G比が有意な低値を示したほか,500 mg/kg投与群の雄ではカルシウム濃度の有意な上昇が認められた.投与期間終了時の雌および回復期間終了時の雌雄では,いずれの検査項目にも対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなかった.追加試験の投与期間終了時の検査では,1000 mg/kg投与群の雄に尿素窒素濃度の有意な上昇がみられ,また,雌にクレアチニン濃度およびアルカリフォスファターゼ活性の有意な上昇と塩素濃度の有意な低下が認められた.回復期間終了時の検査では,雌雄ともいずれの検査項目にも対照群と1000 mg/kg投与群の間に有意な差は認められなかった.

7. 病理学検査

1) 肉眼所見

第一期試験では,投与期間終了時および回復期間終了時解剖例の肉眼所見には異常は認められなかった.追加試験の投与期間終了時の剖検では,対照群の雄1例に皮膚の痂皮,1000 mg/kg投与群の雄1例に片側精巣の大型化が認められた.また,回復期間終了時の剖検では,1000 mg/kg投与群の雄1例の肝臓に淡色部が認められた.なお,雌ではいずれの動物にも肉眼所見に異常は認められなかった.

2) 器官重量(Table 3)

第一期試験では,投与期間終了時および回復期間終了時解剖例の器官重量には,雌雄いずれも有意な差は認められなかった.追加試験の投与期間終了時では,1000 mg/kg投与群の雄で,肝臓の絶対重量に有意な減少,脳,副腎および精巣上体の相対重量に有意な増加が認められた.また,回復期間終了時の1000 mg/kg投与群の雄では,副腎の絶対重量に有意な増加が認められた.なお,雌ではいずれの器官重量にも有意な差は認められなかった.

3) 病理組織学検査(Table 4)

第一期試験の投与期間終了時解剖例の対照群および500 mg/kg投与群では,肝臓,腎臓,脾臓および肺に自然発生性の所見が観察されたが,いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められなかった.また,追加試験においても,投与期間終了時の対照群および1000 mg/kg投与群では,肝臓,腎臓,脾臓,肺,心臓および気管に自然発生性の所見が観察されたが,いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められなかった.また,1000 mg/kg投与群の雄1例で肉眼的に大型化がみられた片側精巣では,組織学的に精細管が拡張し,片側の精巣上体には精子減少が観察された.これらの変化は片側性で,他方の精巣および精巣上体には異常はなかったことから,自然発生性の変化であると判断した.さらに,対照群の雄1例に観察された皮膚の痂皮部位では,病理組織学的に痂皮および表皮の好中球浸潤が観察された.この他,回復期間終了時に,1000 mg/kg投与群の雄1例に観察された肝臓の淡色部には,限局性の鉱質沈着および線維化が認められた.なお,気管支,副腎,卵巣には,いずれも異常は認められなかった.

考察

(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドを,50,150,500および1000 mg/kgの用量で雌雄のSprague-Dawley系ラットに28日間にわたって強制経口投与し,その後14日間の回復期間を設けた.

その結果,1000 mg/kg投与群では,投与期間中に排便量の減少が一過性にみられる例があり,この症状にほぼ一致して軽度な体重減少あるいは増加抑制が認められた.また,投与期間中の対照群と1000 mg/kg投与群の平均体重には有意な差はみられなかったが,1000 mg/kg投与群の雄では投与期間終了時の解剖時体重が有意な低値を示した.さらに,投与期間中の1000 mg/kg投与群の摂餌量は低い傾向にあり,雌雄とも有意差が認められることがあった.体重の増加抑制,摂餌量の減少は,500 mg/kg投与群にも軽度ではあるがその傾向が認められたことから,これらの変化は被験物質投与に起因したものと考えられる.しかし,1000 mg/kg投与群でも体重が順調に増加する例もあり,個体間でバラツキがあること,排便量の減少は一過性であり,病理学検査にも関連した変化が認められなかったことなどから,一部の例でみられる体重の増加抑制は被験物質の毒性影響というより投与刺激等による餌の嗜好性変化によるものと考えられる.

尿検査には,被験物質投与に起因した変化は認められなかった.また,血液学検査,血液生化学検査で,対照群と被験物質投与群との間に有意差が認められた項目があったが,変動の程度としては軽微で他に関連所見がなかったこと,用量依存性のある変化でなかったことなどから,いずれも被験物質投与に起因した変化ではないと考えられた.

器官重量では,投与期間終了時の1000 mg/kg投与群の雄で肝臓の絶対重量が減少し,脳および精巣上体の相対重量が増加したが,これらはいずれも体重の増加抑制により,解剖時体重に差が生じたことによる影響と考えられる.また,1000 mg/kg投与群の雄の副腎で,投与期間終了時の相対重量,回復期間終了時の絶対重量がいずれも増加したが,投与期間終了時の組織学検査で関連する所見がなかったことから,被験物質投与およびその後に続く回復期間に関連のない変化と考えられる.この他,病理組織学的にも被験物質投与に起因したと考えられる変化は認められなかった.

以上のように,(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドを1000 mg/kgの用量で反復投与することにより,雌雄とも一部の例で投与期間中一過性に排便量の減少,軽度な体重の増加抑制がみられたが,これら以外には生体の機能および形態の明らかな変化はなく,毒性影響は認められなかった.したがって,本試験条件下における(メタクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドの無影響量は,雌雄とも1000 mg/kg/dayであると判断された.

連絡先
試験責任者:畔上二郎
試験担当者:原田知子,加藤博康,関 剛幸,古谷真美,永田伴子,吉村愼介,堀内伸二,稲田浩子,三枝克彦,安生孝子
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Jiro Azegami(Study Director) Tomoko Harada, Hiroyasu Katoh, Takayuki Seki, Mami Furuya, Tomoko Nagata, Shinsuke Yoshimura, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
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