1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)
エステルのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
Tris(2-ethylhexyl) 1,2,4-benzenetricarboxylate in Rats

要約

1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルは,塩化ビニル用可塑剤として使用される化合物である.本化合物の毒性については,ほとんど報告がないため,今回,既存化学物質の安全点検に係わる毒性調査事業の一環として,SD系ラットを用いる強制経口投与による28日間反復投与毒性試験を実施した.

ラットは 1群雌雄各5匹で4試験群,対照群および高用量群には雌雄各5匹の回復群を設け,計60匹を使用した.

1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルは,コーンオイルに溶解し,0, 100, 300および1000 mg/kgを毎日1回,4週間連続経口投与し,一般状態の観察,体重測定,摂餌量測定,血液学検査,血液凝固検査,血液生化学検査,尿検査,器官重量測定および病理学検査を行った.なお,回復期間は2週間とし,投与終了時と同様な検査を実施した.

その結果は,次のとおりである.

一般状態の観察では,雌雄いずれの群にも異常動物は観察されず,死亡例もなかった.

体重,摂餌量,飼料効率,および血液生化学検査および器官重量には,雌雄とも被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.

血液学検査の結果,雌雄とも被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.

尿検査の結果,雌雄の 1000 mg/kg群で尿量が増加した動物が認められたが,平均尿量および尿比重に有意差は認められなかった.

病理学検査の結果,肉眼および組織学的検索ともに,被験物質投与の影響が示唆される病変は観察されなかった.なお,肉眼所見において肺の有色斑/区域が,組織所見において腎臓の好酸性小体が,対照群に比べ雄の投与群に多く観察されたが,いずれも自然発生性病変が偶発的に増加したものと考えられた.

以上の結果,雌雄とも無影響量は 1000 mg/kg/dayと判断された.

材料および方法

1. 被験物質

1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステル (CAS No.3319-31-1,大八化学工業(株)提供) は淡黄色透明の油溶性液体で,分子式C33H54O6,分子量546.87の化合物である.本試験に用いたロットN-60601の純度は99.0%以上であった.

2. 供試動物

供試したラット [Crj:CD(SD)系,SPF]は日本チャールス・リバー(株)(神奈川県)から4週齢で購入した.動物を検収後,試験環境に9日間馴化させた後,6週齢で投与を開始した.動物はあらかじめ体重によって層別化し,無作為抽出法により各試験群を構成するように群分けした.動物の識別は,個別飼育ケージに動物標識番号(Animal ID-No.)を付すことにより行った.投与開始時の体重は雄で130〜151 g,雌で110〜121 gであった.

3. 飼育条件

動物はバリアシステムの飼育室で飼育し,環境調節の目標値は温度 23±2℃,相対湿度55±10%,換気回数20回/時,照明150〜300 lux,12時間(午前7時点灯,午後7時消灯)とした.(株)東京技研サービスの水洗式飼育機を使用し,金属製前面・床網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容し,オリエンタル酵母工業(株)製造の放射線滅菌改良NIH公開ラット・マウス飼料および水道水を自由に摂取させた.飼育ケージは隔週1回,給餌器は週1回取り換えた.

なお,動物の馴化期間を含め,投与および回復期間中,データの信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因の変化はなかった.

4. 試験群の構成

試験群は 0,100,300および1000 mg/kgの4群とし,1群雌雄各5匹を用い,0および1000 mg/kg群に雌雄各5匹の回復群を設け,計60匹を使用した.

〔用量設定理由〕

本試験に先立って用量設定のための 2週間投与試験 (投与量:0,200,600および1800 mg/kg)を実施した.その結果,一般状態,体重,摂餌量,血液学検査,血液生化学検査,器官重量および病理学検査において被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.従って,28日間反復投与試験の高用量は,1000 mg/kgとし,以下公比3で除し,中用量を300 mg/kg,低用量を100 mg/kgに設定した.

5. 投与方法

被験物質の投与経路は経口とした.被験物質はコーン油に溶解し,胃ゾンデを用いて経口投与した.投与容量は体重 100 g当り0.5 mlとした.対照群には溶媒のみ投与した.

6. 投与液の調製,分析

被験物質は,各用量 (100,300および1000 mg/kg)ごとに所定量を精秤し,コーン油(ナカライテスク(株))に溶解した.投与液は調製後,冷蔵庫保存で1週間安定であることが確認されているので,本試験においては毎週1回調製を行い,1日分毎に小分けをし使用時まで冷蔵庫に保管した.投与液の濃度分析をすべての群に関し投与1および4週の調製液について実施した結果,設定濃度の98.0〜102%の範囲であり,適切に調製されていた.

7. 投与期間

投与期間は 28日間とし,投与終了後0および1000 mg/kg群について2週間の回復試験を実施した.

8. 観察,測定および検査

1) 一般状態の観察

全動物を毎日午前,午後の 2回観察し,中毒症状の有無,行動異常,死期の迫った動物および死亡動物の有無等を記録した.

2) 体  重

投与開始から回復試験終了時まで,毎週 1回測定した.

3) 摂餌量

毎週 1回給餌した残量を測定し,飼料摂取量(g/week)を算出した.

4) 臨床検査

投与終了時および回復期間終了時の計 2回実施した.採血するに当り,動物は約16時間絶食させた.動物をエーテルで麻酔後開腹し,腹部大動脈から採血した.

a. 血液学検査

EDTA-3Kを添加した初血を用い,白血球数(WBC:暗視野板法),赤血球数(RBC:暗視野板法),ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法),ヘマトクリット値(HCT:RBC, MCVより算出),平均赤血球容積 (MCV:暗視野板法),平均赤血球血色素量(MCH:HGB, RBCより算出),平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB, HCTより算出),血小板数(PLT:暗視野板法)および白血球百分率(フローサイトケミストリー法)を血液自動分析装置THMS H・1E(米国マイルス社)を用いて測定した.

網赤血球 (RC)率算定用に,血液塗抹標本を作製しメイ・グリュンワルド・ギムザで染色後,鏡検した.

また,クエン酸ソーダ添加血液の血漿について,プロトロンビン時間 (Quick 1段法),活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)およびフィブリノーゲン量 (トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)を用いて測定した.

b. 血液生化学検査

血清を用いて,総蛋白 (ビューレット法),アルブミン(B.C.G.法),A/G比(計算値),血糖(グルコースオキシダーゼ法),中性脂肪(酵素法),総コレステロール(酵素法),尿素窒素(BUN:ウレアーゼアンモニア法),総ビリルビン(ジアゾ色素法),カルシウム(アルセナゾ型Я破),無機リン(モリブデン酸ブルー法),ナトリウム(電極法),カリウム(電極法)および塩素(電極法)をEKTACHEM 700N(米国コダック社)で,クレアチニン(Jaff法),グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT:IFCC法),グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT:IFCC法),γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP:Szasz改法)およびアルカリホスファターゼ(ALP:Bessey-Lowry-Brock改良法)をCentrifiChem ENCORE(米国ベーカー社)で測定した.

c. 尿検査

血液学検査に先立ち,採尿器を用いて 24時間(午前10時から翌日午前10時まで)尿を採取し,尿量,色調および濁度を検査後,尿比重計UR-S((株)アタゴ)を用いて尿比重を測定した.また,尿を遠心分離後Sternheimer変法により沈渣を染色し,鏡検した.pH,潜血,ケトン体,糖,蛋白,ビリルビンおよびウロビリノーゲンについて,N-マルティスティックスSG試験紙(マイルス・三共(株))およびCLINITEK 200(米国マイルス社)を用いて測定した.

5) 病理学検査

病理解剖は投与終了時および回復期間終了時に動物をエーテル麻酔し,放血致死させ実施した.肉眼的異常を病理解剖所見記録シートに記録した.また,脳,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,精巣および卵巣について重量を測定し,器官重量・体重比を算出した.上記重量測定器官と下垂体,眼球,甲状腺 (上皮小体を含む),心臓,肺,胃,膀胱,骨髄(大腿骨)および肉眼所見で変化が認められた雄の肺を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した.

病理組織学検査は固定した器官・組織のうち,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,副腎および骨髄 (大腿骨)については対照群と高用量群,雄の腎臓についてはすべての群について行った.常法に従って薄切標本を作製し,ヘマトキシリン・エオジン染色し鏡検した.

6) データの記録および統計分析

各試験群の体重,摂餌量,血液学検査値,血液生化学検査値,尿検査値 (尿量および尿比重のみ),器官重量および器官重量・体重比は,下記に示した自動判別方式に従い,最初にBartlettの等分散検定を実施した.等分散の場合は一元配置の分散分析を行い,分散が有意で各群の標本数が同数の場合はDunnettの多重比較検定,各群の標本数が異なる場合はDuncanの多重範囲検定で対照群と各投薬群間の有意差を検定した.Bartlettの等分散検定で不等分散の場合はKruskal-Wallisの順位検定を実施し,有意の場合はノンパラメトリックのDunnettの多重比較検定で対照群と各被験物質投与群間の有意差を検定した.また,病理学検査結果についてはFisherの直接確率検定を実施した.なお,用量相関性については,Jonckheereの傾向検定を用いて有意差を検定した.

有意水準は 5および1%の片側検定で実施した.

試験結果

1. 死亡率

投与期間中,雌雄とも対照群を含むすべての試験群で死亡例は認められなかった.

また,回復期間中,雌雄とも対照群および 1000 mg/kg群で死亡例は認められなかった.

2. 一般状態の観察

投与期間および回復期間を通じて,雌雄いずれの群にも異常動物は観察されなかった.

3. 体  重

投与期間および回復期間を通じて,雌雄とも対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.

4. 摂 餌 量

投与期間および回復期間を通じて,雌雄とも対照群と被験物質投与群とで差が認められず, 0〜4週および5〜6週の総摂餌量にも差は認められなかった.

5. 血液学検査(Table 1)

〔投与終了時の検査結果〕

血液学検査に関しては,雌雄とも検査したすべての項目について,対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.

血液凝固検査に関しては,雄では, 1000 mg/kg群で対照群に比較してプロトロンビン時間が僅かに延長を示したが,生理的変動の範囲内の値であった.雌では,対照群と被験物質投与群とで3項目とも差が認められなかった.

〔回復試験終了時の検査結果〕

血液学検査に関しては,雌の 1000 mg/kg群で対照群に比較してヘモグロビン量が僅かに高値を示したが,生理的変動の範囲内の値であった.その他の項目は雌雄とも対照群と差がなかった.

血液凝固検査に関しては,すべての検査項目について雌雄の 1000 mg/kg群と対照群とで差がなかった.

6. 血液生化学検査(Table 2)

〔投与終了時の検査結果〕

雄では,検査を行ったすべての項目について対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.雌では,対照群に比較して 300および1000 mg/kg群で塩素が低値を示した.

〔回復試験終了時の検査結果〕

雄の 1000 mg/kg群で対照群に比較してカリウムの僅かな高値が,また,雌の1000 mg/kg群で対照群に比較してGOTの僅かな高値が認められたが,軽微な変化であり,投与終了時にはこれらの項目で変化が認められておらず意義のある変化ではなかった.その他の項目は雌雄とも対照群と差がなかった.

7. 尿 検 査(Table 3)

〔投与終了時の検査結果〕

雌雄とも 1000 mg/kg群で尿量の増加した動物が認められたが,平均尿量および雌雄とも1000 mg/kg群で尿比重は対照群と差が認められなかった.

〔回復試験終了時の検査結果〕

雌雄とも 1000 mg/kg群はすべての検査項目で対照群との間に明確な差が認められなかった.

8. 器官重量(Table 4)

〔投与終了時の検査結果〕

雌雄とも重量測定を行ったすべての器官について,対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

〔回復試験終了時の検査結果〕

雌の 1000 mg/kg群で対照群に比較して副腎重量が高値を示した.その他の器官は雌雄とも1000 mg/kg群と対照群とで差が認められなかった.

9. 器官重量・体重比(相対重量)(Table 4)

〔投与終了時の検査結果〕

雌の 100 mg/kg群で対照群に比較して肝臓相対重量が高値を示したが,用量相関性のない変化であった.その他の器官は雌雄とも,対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.

〔回復試験終了時の検査結果〕

雄の 1000 mg/kg群で腎臓相対重量の低値,雌の1000 mg/kg群で副腎相対重量の高値が認められた.

10. 病理学検査

a) 剖検所見(Table 5)

投与終了時において,対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見として,肺の有色斑/区域が雄で, 100 mg/kg群の1例,300 mg/kg群の2例,1000 mg/kg群の3例に観察された.その他は,雄に腎臓の嚢胞と肥大,上皮小体の肥大など,雌に胸腺の赤色斑,子宮の内腔拡大など,いづれも1ないし2例の発生にとどまった.回復試験終了時の検査結果において,対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見は観察されなかった.観察された所見はいづれも1ないし2例に発生し,肺の黒色斑,子宮の内腔拡大などであった.

b) 組織所見(Table 6)

投与終了時において,対照群に比較して被験物質投与群に多い発生を示した所見として,腎臓の好酸性小体が雄の対照群, 100 mg/kg群,300 mg/kg群および1000 mg/kg群の順に,0, 1, 1および3例と投与群にやや多く観察された.

その他,肺の出血および細胞浸潤,肝臓の肉芽巣,腎臓の好塩基化,石灰沈着,副腎の空胞化などが観察された.

回復試験終了時の検査結果において,対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見は観察されなかった.腎臓の好酸性小体は対照群でも軽度の所見が 1例観察された.

その他,肺の出血,腎臓の好塩基化,石灰沈着など,投与終了時計画屠殺動物に観察された所見とほぼ同様の所見が観察された.

考察および結論

一般状態の観察で,雌雄いずれの群にも異常動物は認められず死亡例も認められなかった.

体重および摂餌量は,雌雄とも対照群と被験物質投与群で差がなく,被験物質投与の影響は認められなかった.また,体重および摂餌量に変化が認められないことから,飼料効率にも被験物質投与の影響は認められなかった.

血液学検査の結果,雌雄とも被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.また,凝固検査においても被験物質投与の影響を示唆する変化は認められなかった.

血液生化学検査の結果,雄では被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.雌では,対照群に比較して 300および1000 mg/kg群で塩素の低値が認められたが,ナトリウムおよびカリウムに変化は認められず,塩素の変化自体も軽微であることから,毒性学的意義は乏しいと考えられる.

尿検査の結果,雌雄とも 1000 mg/kg群で尿量の増加した動物が認められたが,その他の定性項目,沈渣には被験物質投与の影響を示唆する変化は認められなかった.

器官重量測定の結果,投与終了時の測定では雌雄とも被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった.回復期間終了時の測定では, 1000 mg/kg群の雄で腎臓相対重量の低値,雌で副腎の実重量および相対重量の高値が認められたが,いずれも軽微な変化で,被験物質投与とそれに続く投与の休止に関連した変化とは考えられなかった (背景値,雄腎臓相対重量:0.73±0.06%,n=50,雌副腎実重量;66±7 mg,n=50,雌副腎相対重量:0.028±0.004%,n=50).

病理学検査の結果,対照群と比較して投与群に多くみられた所見として,肉眼所見では投与終了時計画屠殺動物において肺の有色斑/区域が,また,組織所見では腎臓に好酸性小体が,ともに雄にそれぞれ観察された.肺の有色斑/区域については,直径 1〜2 mm程度の褐色あるいは黒色調の小さな斑点が,単一あるいは少数個観察された.組織学的には限局性の出血,その周囲間質への炎症細胞浸潤などで説明される変化と考えられた.これらの組織変化は,雄の全群を通じて発生率ならびに程度に差はみられなかったことから,被験物質投与による変化ではなく,自然発生的な変化と考えられた.

また,腎臓の好酸性小体については, hyalin bodyの1種とされており1)d-Limoneneや無鉛ガソリンなどの化学物質の影響で特に雄の近位尿細管での顕著な発生が報告されている2).しかし,本所見は雄に自然発生性にも観察され,過去に当センターで実施した同系統,同週齢の背景値(8試験,雄45匹)によると22.2%(0〜100%)の発生率で観察されていること,雄の1000 mg/kg群に特に多く観察されたものの全例には観察されず,また全投与群を通じて明らかな用量相関もみられないこと,回復試験群の対照群にも観察されたことから,肺の肉眼所見同様,自然発生性病変が偶発的に投与群に多くみられたものと考えられた.また,その他に観察された所見も発生率および程度に用量相関性は認められずすべて自然発生病変と考えられた.

以上のことから,本被験物質は,最大投与可能量の 1000 mg/kg投与でも明確な被験物質投与の影響は示唆されず無影響量は雌雄とも1000 mg/kg/dayと判断された.

参考文献

1)渡辺満利,"泌尿器系,毒性病理学," 前川昭彦,林裕造編,,地人書館,東京,1991,p. 229.
2)Carl L. Alden and Charles H. Frith, "Urinary System, Handbook of toxicologic pathology," ed. by Wanda M. Haschek and Colin G. Rousseauk, Academic Press, Inc., San Diego, 1991, pp.340-342

連絡先
試験責任者:井上博之
試験担当者:各務 進,庄子明徳,渡 修明,
小林和雄,山本慎二
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-12静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Hiroyuki Inoue (Study director),
Susumu Kakamu, Akinori Shoji,
Nobuaki Watari, Kazuo Kobayashi,
Shinji Yamamoto
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-Pyo Center)
582-2 Shioshinden Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393