トリレンジイソシアナートのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Tolylene diisocyanate in Rats

要約

トリレンジイソシアナートについてSD系のラットを用い,0,30,100および300 mg/kgの用量で28日間反復経口投与毒性試験を実施した.なお,対照群および300 mg/kg群にはそれぞれ雌雄各5匹の14日間回復群を設けた.

一般状態の観察では,雌雄とも100および300 mg/kg群で流涎が認められた.流涎は,用量に対応して発現時期が早く,例数も多くなり,また程度も増強したが,回復期間の投与中止により症状は消失した.

体重および摂餌量測定の結果,雌では被験物質投与の影響は認められなかったが,雄の100および300 mg/kg群で投与期間の体重および体重増加量に低値傾向が認められた.雄の300 mg/kg群では回復期間にも体重の低値が認められたが,回復傾向を示した.

血液学検査の結果,雄の300 mg/kg群で投与期間終了時に好中球数の増加による白血球数の高値,網赤血球率の高値,血小板数の高値傾向が認められた.同群では回復期間終了時にも網赤血球率の高値が認められた.また,好中球数および血小板数の高値も回復期間終了時に認められたが,これらは回復傾向を示した.雌の300 mg/kg群で投与期間終了時に異常は認められなかったが,回復期間終了時に網赤血球率の高値が認められた.

血液生化学検査の結果,雄の300 mg/kg群で総蛋白およびアルブミンの低値が認められ,総コレステロールおよびALTの高値が認められた.さらに雄の100 mg/kg群で総蛋白の低値傾向が認められ,ALTの高値が認められた.また,雌の300 mg/kg群で総コレステロールの高値が認められた.回復期間終了時にも雄の300 mg/kg群でALTの高値は認められたが,その他の変化は回復を示した.

血液凝固能検査,蛋白電気泳動検査および尿検査の結果,雌雄とも被験物質投与の影響は認められなかった.

器官重量測定の結果,雄の300 mg/kg群で回復期間終了時に脾臓重量および脾臓相対重量の高値が認められた.雌では被験物質投与の影響は認められなかった.

病理学検査の結果,投与期間終了時の剖検では胃の肥厚が雌雄の300 mg/kg群で5例全例に,小腸の肥厚が雄の300 mg/kg群で4例に観察された.組織検査では,肺の気管支肺炎が雄の300 mg/kg群,雌の30および100 mg/kg群で各1例に,肺の気管支上皮の再生および線毛消失が雄では100 mg/kg以上の群で,雌では30 mg/kg以上の群で,さらに気管においても同様の変化が雌雄ともに30 mg/kg以上の群で観察された.また,腺胃のびらんが雌雄の300 mg/kg群で各1例に観察された.脾臓についてベルリンブルー染色を行ったところ,雌雄とも対照群に比較し300 mg/kg群で増強する傾向がみられた.一方,肝臓の脂肪化が雌雄の300 mg/kg群で減少していた.回復期間終了時の剖検所見では被験物質投与に起因する変化は観察されなかった.組織所見では,雄において脾臓の色素沈着が被験物質投与群で増加する傾向にあった.また,脾臓の色素沈着についてベルリンブルー染色を実施したところ陽性を示し,雄では300 mg/kg群で明らかな増強を認め,雌でも同様の傾向がみられ,いずれも回復期間終了時解剖動物でさらに強くなる傾向にあった.これは,投与期間中に傷害された赤血球が回復期間後も徐々に破壊した結果と考えられた.その他には被験物質投与に起因する変化は観察されず,投与期間終了時解剖動物で観察された肺,気管,胃,小腸および肝臓の誘発病変は可逆性変化と考えられた.

以上の結果,トリレンジイソシアナートの標的器官は脾臓,肺,気管,胃,小腸および肝臓と判断された.30 mg/kg群では雌雄とも無影響量が確認できなかったため,NOELは雌雄とも30 mg/kg未満と判断された.

方法

1. 被験物質

トリレンジイソシアナート[日本ポリウレタン工業(株)(東京)提供,Lot No. 171,純度99 wt%以上]は無色または淡黄色の液体で,水と反応してCO2を発生し,また紫外線により黄変する性質を持った化合物である.被験物質は,使用時まで密栓,室温,遮光の条件下で保管された.なお,本ロットは投与期間中安定であることが確認された.

2. 供試動物

供試したSprague-Dawley系ラット[Crj:CD(SD)IGS系,SPF]は日本チャールス・リバー(株)から4週齢で購入した.動物を検収後,試験環境に9日間馴化させた後,5週齢で投与を開始した.動物はあらかじめ体重によって層別化し,無作為抽出法により各試験群を構成するように群分けした.投与開始時の体重は雄が140〜156 g,雌が116〜132 gであった.

3. 飼育条件

動物は,温度21.8〜25.0 ℃,湿度46〜67 %,換気回数毎時20回,照明12時間(午前7時点灯,午後7時消灯)のバリアシステム飼育室で飼育した.水洗式飼育機を使用し,金属製前面・床網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容した.オリエンタル酵母工業(株)製造の放射線滅菌改良NIH公開ラット・マウス飼料および水道水を自由に摂取させた.飼育ケージは隔週1回,給餌器は週1回取り換えた.

4. 試験群の構成

試験群は1群雌雄各5匹からなる0,30,100および300 mg/kgの4群ならびに0および300 mg/kgの回復群を設け,計60匹を使用した.

[用量設定理由]

用量設定のための2週間反復投与試験を0,100,300および1000 mg/kgの4用量で実施した結果,300 mg/kg以上の群で雌雄とも流涎および前胃の肥厚が観察された.したがって,28日間反復投与毒性試験の高用量を300 mg/kgとし,以下公比約3で除して中用量を100 mg/kg,低用量を30 mg/kgと設定した.

5. 投与方法

被験物質はコーン油(ナカライテスク(株))に溶解し,胃ゾンデを用いて胃内に強制経口投与した.投与容量は体重100 g当たり0.5 mLとした.対照群には媒体のみ投与した.なお,投与期間は28日間とし,0および300 mg/kg群についてはさらに投与期間終了後に2週間の回復期間を設けた.

6. 投与液の調製

被験物質は,各用量ごとに所定量を精秤し,コーン油に溶解した.コーン油中のトリレンジイソシアナートは,室温・遮光の条件下で6時間安定であることを確認した上で,投与液の調製は毎日1回,投与直前に実施し,投与まで密栓,室温,遮光で保管した.各投与液の被験物質濃度を測定した結果,初回調製時は設定濃度の105.6〜107.5 %,最終調製時は100.4〜101.6 %であり,適切に調製されていることが確認された.

7. 観察,測定および検査

1) 一般状態の観察

全動物を投与期間中は毎日3回(投与前,投与後1および5時間)観察し,中毒症状の有無,行動異常,死期の迫った動物および死亡動物の有無等を記録した.

2) 体重

投与開始から回復期間終了時まで,毎週1回測定した.

3) 摂餌量

毎週1回飼料の残量を測定し,飼料摂取量(g/week)を算出した.

4) 血液学検査

投与期間終了時および回復期間終了時の計2回実施した.動物を約16時間絶食させた後,動物をエーテルで麻酔後開腹し,腹部大動脈から採血した.採取した血液の一部にEDTA-2Kを添加し,白血球数(WBC:フローサイトメトリー法),赤血球数(RBC:暗視野板法),ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法),ヘマトクリット値(HCT:RBC, MCVより算出),平均赤血球容積(MCV:暗視野板法),平均赤血球血色素量(MCH:HGB, RBCより算出),平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB, HCTより算出),血小板数(PLT:暗視野板法)および白血球百分率(フローサイトメトリー法)を血液自動分析装置THMS H・1E(マイルス社)を用いて測定した.さらに,3.13 %クエン酸ナトリウム水溶液添加血液の血漿を用いて,プロトロンビン時間(PT:Quick 1段法),活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT:クロット法)およびフィブリノーゲン量(Fibrinogen:トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)を用いて測定した.

網赤血球(Reticulocyte)率算定のため抗凝固剤(EDTA-2K)添加血液をニューメチレンブルーで染色後,血液塗抹標本を作製した.病理学検査で脾臓に血色素沈着が認められたため,この血液塗抹標本を鏡検した.

5) 血液生化学検査

血液学検査に引き続き採取した血液を静置後,遠心分離して得られた血清を用いて,総蛋白(T. protein:Biuret法),アルブミン(Albumin:BCG法),A/G比(A/G:計算値),血糖(Glucose:HK-G-6-PDH法),中性脂肪(Triglyceride:GK-GPO遊離グリセロール消去法),総コレステロール(T. cholesterol:コレステロールオキシダーゼESET法),尿素窒素(BUN:ウレアーゼGLDH法),クレアチニン(Creatinine:酵素法),総ビリルビン(T. bilirubin:バナジン酸酸化法),アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST:酵素-UV法),アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT:酵素-UV法),アルカリホスファターゼ(ALP:P-ニトロフェニルリン酸基質法),γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP:L-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4NA基質法,JSCC),コリンエステラーゼ(Cholinesterase:DTNB法,基質:ブチリルチオコリン),カルシウム(Calcium:MXB法)および無機リン(I. phosphorus:PNP-XDH法)を多項目生化学自動分析装置日立7170((株)日立製作所)を用いて,ナトリウム(Sodium:イオン選択電極法),カリウム(Potassium:イオン選択電極法)および塩素(Chloride:イオン選択電極法)を電解質測定装置EA06R((株)エイアンドティー)を用いて測定した.

6) 蛋白電気泳動検査

血液生化学検査で総蛋白またはアルブミンに変化が認められたため,全自動電気泳動分析装置(エパライザ,ヘレナ研究所)を用い,蛋白電気泳動検査を行った.タイタンセルロースアセテート膜を支持体として血液生化学検査に用いる血清を電気泳動し,泳動終了後ポンソーS溶液で染色後,同装置のデンシトメーターを用いて各分画の比率を測定するとともにA/Gを算出した.なお,血液生化学検査で算出したA/Gは試験報告に反映させなかった.

7) 尿検査

投与期間終了週および回復期間終了週の計2回実施した.採尿器を用いて約3時間および約24時間の尿を採取し,3時間尿を用いてpH,潜血,ケトン体,糖,蛋白,ビリルビンおよびウロビリノーゲンについて,試験紙(N-マルティスティックスSG,バイエル・三共(株))および尿分析装置(CLINITEK 500,バイエル社)で測定した.また,24時間尿を用いて,尿量および色調を検査後,尿比重計UR-S((株)アタゴ)で尿比重を測定するとともに,尿を遠心分離後Sternheimer変法により沈渣を染色し,鏡検した.

8) 病理学検査

投与期間終了時および回復期間終了時に動物をエーテル麻酔し,放血安楽死させ病理解剖を実施した.また,脳,肺,肝臓,腎臓,副腎,胸腺,心臓,脾臓,精巣,精巣上体および卵巣について重量を測定し,器官重量/体重比を算出した.上記重量測定器官と脊髄,下垂体,眼球,唾液腺(顎下腺,舌下腺),甲状腺,上皮小体,気管,膵臓,胃,小腸(パイエル氏板を含む),大腸,精嚢,前立腺,子宮,腟,膀胱,末梢神経(坐骨神経),リンパ節(下顎リンパ節,腸間膜リンパ節),骨髄(大腿骨),大動脈,皮膚,乳腺,その他肉眼観察で変化が認められた器官および組織は十分な量の10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した.但し,精巣および精巣上体はブアン液で前固定した後,10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した.

病理組織学検査は固定した器官・組織のうち,投与期間終了時に解剖した対照群および高用量群の胸腺,心臓,肺(気管支含む),気管,肝臓,膵臓,脾臓,腎臓,副腎,胃,小腸,大腸,精巣,精巣上体,子宮,卵巣,骨髄(大腿骨),大動脈および乳腺について実施した.また,前述の器官で特に中および高用量群で発生の増加が認められた雌雄の肺,気管,肝臓について低用量群および回復群についても実施した.回復期間終了時の解剖動物で脾臓重量の増加が認められたため,雌雄の脾臓について低用量群,中用量群および回復群についても実施した.常法に従ってパラフィン包埋,薄切後,ヘマトキシリン・エオジンで染色し,鏡検した.さらに脾臓については色素沈着の同定および確認のため,薄切後,ベルリンブルーで染色し,鏡検した.

8. 統計解析

体重,摂餌量,血液学検査値,血液生化学検査値,蛋白電気泳動検査値,尿検査値(尿量および尿比重のみ),器官重量および器官重量/体重比について,対照群と各投与群間の有意差を検定した.最初にBartlettの等分散検定を実施した.等分散の場合はDunnettの多重比較検定1, 2)で対照群と各投与群間の有意差を検定した.Bartlettの等分散検定で不等分散の場合はSteelの検定3)で対照群と各投与群間の有意差を検定した.上記定量値の有意水準は5および1 %の片側検定で実施した.また,生存率および病理学検査結果の検定はFisherの確率計算法を用いた.

結果

1. 死亡率

投与期間中および回復期間中,雌雄とも対照群を含む全ての試験群で死亡例は認められなかった.

2. 一般状態の観察

雄では,300 mg/kg群で投与7日に流涎を示す例が認められ,投与期間終了日まで,10例中2から全例にほぼ毎日観察された.流涎の程度は,口の周囲を濡らすものが多数を占め,顎下部に達するものも一部の例に認められた.また,100 mg/kg群で投与16日に口の周囲を濡らす流涎を示す例が認められ,投与27日まで5例中1から2例で散発的に観察された.

雌では,300 mg/kg群で投与7日に流涎を示す例が認められ,投与期間終了日まで,10例中1から9例にほぼ毎日観察された.流涎の程度は,口の周囲を濡らすものが多数を占め,顎下部に達するものも一部の例に認められた.また,100 mg/kg群で投与16日に口の周囲を濡らす流涎を示す例が認められ,投与25日まで5例中1から2例で散発的に観察された.

回復期間では,雌雄いずれの群にも異常を示す動物は観察されなかった.

3. 体重(Fig. 1)

雄では,100および300 mg/kg群で投与4週の体重および投与4週間の体重増加量が低値傾向を示した.また,回復期間において300 mg/kg群で回復1週の体重が低値を示したが,回復2週間の体重増加量は差を示さなかった.

雌では,投与期間および回復期間を通じ,対照群と被験物質投与群で差は認められなかった.

4. 摂餌量

雌雄とも投与期間および回復期間を通じ,対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

5. 血液学検査(Table 1)

[投与期間終了時の検査結果] 雄では,300 mg/kg群で白血球数,好中球数および網赤血球率が高値を示し,血小板数が高値傾向を示した.雌では,300 mg/kg群でMCHが高値を示した.その他,100 mg/kg群で赤血球数が低値を示したが,用量に対応する変化ではなかった.

[回復期間終了時の検査結果]

雄では,300 mg/kg群でリンパ球比率が低値を示し,血小板数,好中球数,好中球比率および網赤血球率が高値を示した.雌では,300 mg/kg群でMCVおよび網赤血球率が高値を示し,MCHCが低値を示した.

6. 血液生化学検査(Table 2)

[投与期間終了時の検査結果]

雄では100および300 mg/kg群でALTが高値を示し,さらに300 mg/kg群で総蛋白およびアルブミンが低値を,総コレステロールが高値を示し,100 mg/kg群で総蛋白が低値傾向を示した.その他,100 mg/k

g群で尿素窒素が高値を示したが,用量に対応しない変化であった.雌では,300 mg/kg群で総コレステロールが高値を示した.その他,30 mg/kg群の血漿コリンエステラーゼが高値を示したが,用量に対応しない変化であった.

[回復期間終了時の検査結果]

雄では,300 mg/kg群でALTが高値を示した.その他,雄の300 mg/kg群で認められたカルシウムの低値,総ビリルビンおよびASTの高値,雌の300 mg/kg群で認められたアルブミンの低値 ,塩素およびアルカリホスファターゼの高値は,投与期間終了時には認められなかった変化であることから,被験物質投与との関連は示唆されなかった.

7. 蛋白電気泳動検査

[投与期間終了時の検査結果]

雄では,対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.雌では,300 mg/kg群でα1-グロブリン比率が低値を示し,アルブミンおよびA/G比が高値を示した.

[回復期間終了時の検査結果]

雄では,300 mg/kg群でα1-グロブリン比率が低値を示し,bグロブリン比率が高値を示したが,投与期間終了時には認められなかった変化であることから,被験物質投与との関連は示唆されなかった.

雌では,対照群と300 mg/kg群で差は認められなかった.

8. 尿検査(Table 3)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも,対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

[回復期間終了時の検査結果]

雌雄とも,対照群と300 mg/kg群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

9. 器官重量(Table 4)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも,対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

[回復期間終了時の検査結果]

雄では,300 mg/kg群で脾臓重量が高値を示した.雌では,対照群と300 mg/kg群とで差は認められなかった.

10. 器官重量/体重比(相対重量)(Table 4)

[投与期間終了時の検査結果]

雄では,100および300 mg/kg群で腎臓相対重量が高値を示した.その他,100 mg/kg群で脳および肺相対重量が高値を示したが用量に対応しない変化であった.雌では,対照群と被験物質投与群で差は認められなかった.

[回復期間終了時の検査結果]

雄では,300 mg/kg群で脾臓相対重量が高値を示した.その他,300 mg/kg群で精巣上体相対重量,雌の肺相対重量が高値を示したが,投与期間終了時には認められなかった変化であることから,被験物質投与との関連は示唆されなかった.

11. 病理学検査

1) 剖検所見(Table 5)

[投与期間終了時計画解剖動物]

対照群に比較して被験物質投与群で有意に増加した病変として,雌雄の300 mg/kg群で胃の肥厚が5例全例に,雄の300 mg/kg群で小腸の肥厚が4例に観察された.対照群に発生がなく被験物質投与群で発生した病変として,肺の褐色化が雌の30 mg/kg群で1例に,胃の赤色斑が雌の300 mg/kg群で1例に,小腸の憩室形成が雄の30 mg/kgで1例に,腎臓では腎盂拡張が雄の30 mg/kg群で1例に,瘢痕が雌の300 mg/kg群で1例に,子宮の内腔拡張が30および300 mg/kg群でそれぞれ1例に観察された.その他,観察された所見は,発生率において対照群と投与群間で明らかな差を示さなかった.

[回復期間終了時計画解剖動物]

剖検所見では,対照群に比較して300 mg/kg群で有意に増加した病変は観察されなかった.

組織検査では,対照群に比較して300 mg/kg群で有意に増加した病変は観察されなかった.対照群に発生が無く300 mg/kg群で発生した病変として,脾臓の色素沈着が雄の300 mg/kg群で3例に観察された.また,脾臓についてベルリンブルーで染色した結果,全例で陽性であった.雄では対照群の全例が軽度であったのに対し300 mg/kg群では軽度が1例,中等度が4例,雌では対照群で中等度が2例,高度が3例であったのに対し,300 mg/kg群では全例が高度であった.

2) 組織所見(Table 6)

[投与期間終了時計画解剖動物]

対照群に比較して被験物質投与群で有意に増加した病変はなかった.対照群に発生が無く被験物質投与群で発生した病変として脾臓の色素沈着が雌の300 mg/kg群で1例に,肺では水腫が雄の300 mg/kg群で1例,気管支肺炎が雄の300 mg/kg群で1例,雌の30および100 mg/kg群で各1例に,細胞浸潤あるいは炎症性細胞浸潤が300 mg/kg群の雄で2例,雌で1例,気管支の再生および線毛消失が雄の100および300 mg/kg群で各3例,雌の30,100および300 mg/kg群でそれぞれ1,1および2例に観察された.気管においても再生および線毛消失が30,100および300 mg/kg群の雄で1,3および3例,雌で1,2および1例に,細胞浸潤が雌の30 mg/kg群で1例に認められた.胃においては水腫が雌雄の300 mg/kgの各1例に,腺腔拡張が雄の30および300 mg/kg群にそれぞれ1例,腺胃のびらんが雌雄の300 mg/kg群で各1例に,細胞浸潤が雄の300 mg/kg群で1例に観察された.腎臓では好酸性小体が雄の20,100および300 mg/kg群にそれぞれ2,1および1例,リンパ球浸潤が雄の20,100および300 mg/kg群に各1例,腎盂拡張が雄の30 mg/kg群の2例に認められた.子宮では血管拡張が300 mg/kg群の1例に,内腔拡張が30および300 mg/kg群でそれぞれ4および1例に観察された.一方,肝臓の脂肪化は0,30,100および300 mg/kg群の雄で3,3,1および0例,雌で3,3,2および0例に観察され,雌雄とも用量に対応して発生数の減少を示した.また,脾臓についてベルリンブルーで染色した結果,雄の対照群の1例を除く雌雄の全例で陽性であった.雌雄ともに100 mg/kg以下の群では全て軽度であったが,300 mg/kg群では雄においては軽度が3例,中等度が2例,雌においては軽度が4例,中等度が1例であった.その他の諸所見は,発生率あるいは程度において対照群と投与群間で明らかな差を示さなかった.

考察

一般状態の観察では,雌雄とも100および300 mg/kg群で流涎が認められた.流涎は,用量に対応して発現時期が早く,例数も多くなり,また程度も増強したが,回復期間の投与中止により症状は消失した.トリレンジイソシアナートには粘膜刺激性のあることが報告されているので4),この流涎は被験物質投与による変化と考えられた.

体重および摂餌量測定の結果,雌では被験物質投与の影響は認められなかった.雄の100および300 mg/kg群で投与4週の体重および投与4週間の体重増加量に低値傾向が認められたが,これらの群で摂餌量に変化は認められなかったため,後述する消化管および肝臓に対する影響に関連する変化と考えられた.雄の300 mg/kg群では回復1週にも体重の低値が認められたが,回復2週間の体重増加量に差は認められなかったことから,回復傾向が認められた.

血液学検査の結果,雄の300 mg/kg群で好中球数の増加による白血球数の高値および血小板数の高値傾向が認められ,回復期間終了時にも好中球数および血小板数の高値が認められた.好中球数および血小板数の高値は,肺に炎症浸潤が認められていることから被験物質による標的器官での炎症性反応を示唆する変化と考えられた.回復期間終了時に認められた好中球数および血小板数の高値は,投与期間終了時の測定値と比較して低い値を示しており,回復傾向が認められた.赤血球造血能に関連する変化として網赤血球率の高値が投与期間終了時に雄の300 mg/kg群および回復期間終了時に雌雄の300 mg/kg群で認められたが,血球数や造血器系臓器の組織像で異常は認められず,毒性学的意義の乏しい変化であった.その他,雌での300 mg/kg群で投与期間終了時に認められたMCHの高値,回復期間終了時に認められたMCVの高値およびMCHCの低値は,ヘマトクリット値,ヘモグロビン量および赤血球数に変化はなかったことから,毒性学的意義はないと考えられた.血液凝固能検査の結果,雌雄とも被験物質投与の影響は認められなかった.

血液生化学検査の結果,雌雄の300 mg/kg群で認められた総コレステロールの高値は,被験物質投与による肝臓への影響を示唆する変化と考えられた.総コレステロールの高値は,回復期間終了時には認められず,回復が認められた.同様に,肝臓への影響を示唆する変化として,雄の100および300 mg/kg群でALTの高値および総蛋白の低値または低値傾向が,さらに300 mg/kg群でアルブミンの低値が認められたが,組織所見からは肝細胞の壊死など,関連する像は認められなかった.回復期間終了時には.総蛋白およびアルブミンの低値は回復を示した.

蛋白電気泳動検査の結果,雌の300 mg/kg群で認められたα1-グロブリン比率の低値,α1-グロブリン比率およびA/G比の高値は,血液生化学検査での総蛋白に変化は認められないことから,毒性学的意義はないと考えられた.

尿検査の結果,雌雄とも被験物質投与の影響は認められなかった.

器官重量測定の結果,雄では300 mg/kg群で回復期間終了時に脾臓重量および脾臓相対重量の高値が認められ,脾臓の組織検査で対応する変化が認められたことから,被験物質投与による影響と判断された.また,雄の100および300 mg/kg群で腎臓相対重量の高値が認められたが,いずれも対応する器官の剖検所見または組織所見に変化が認められないことから,被験物質投与との関連は示唆されなかった.回復期間終了時に雌の300 mg/kg群で認められた肺相対重量の高値は,投与期間終了時には認められなかった変化であることから,被験物質投与との関連は示唆されなかった.

病理学検査の結果,投与期間終了時において被験物質投与による影響が示唆される病変として,剖検所見では胃の肥厚が雌雄の300 mg/kgで,小腸の肥厚が雄の300 mg/kg群で観察されたが,組織所見ではそれらを裏づける変化は観察されなかった.組織所見では,脾臓,肺,気管,胃および肝臓で被験物質投与によると考えられる変化が観察された.脾臓ではH.E.染色標本にて,投与期間終了時解剖動物の雌の300 mg/kg群,回復期間終了時解剖動物の雌雄の300 mg/kg群で色素沈着が増加し,ベルリンブルー陽性結果からヘモジデリンであることが示唆された.さらにベルリンブルー染色標本では投与期間終了時および回復期間終了時解剖動物の雌雄の300 mg/kg群で程度が増強する傾向にあり,特に雄においては回復期間終了時解剖動物の方が対照群との程度の差がより明確になる傾向が認められた.この色素がヘモジデリンと同定されたことから,被験物質投与によって赤血球に何らかの障害を及ぼし,溶血を誘発したものと考えられた.しかし,血液学検査結果や造血器系臓器の組織像では急激な溶血やこれに引き続く造血亢進を示す結果は認められていないことから,この赤血球の障害は急激な溶血にまでは到らない,赤血球の寿命が短縮する程度の比較的軽度なものと考えられる.また,回復期間終了時解剖動物の群間比較において程度の差がさらに明瞭になっていたことから,障害された赤血球の破壊と脾臓でのヘモジデリン沈着は投与期間から回復期間にかけて緩慢に進行したものと推察される.なお,トリレンジイソシアナートは水の存在下では加水分解を受けトルエンジアミンに変化しやすく5),この物質はメトヘモグロビン血症を誘発する芳香族アミンのひとつであることから,この分解産物が赤血球障害の一因となったことも考えられる.肺では,気管支肺炎が雄の300 mg/kg群,雌の30および100 mg/kg群に観察された.また肺の気管支上皮の再生像および線毛消失が雄では100 mg/kg以上の群で,雌では30 mg/kg以上の群で観察され,さらに気管においても同様の変化が雌雄ともに30 mg/kg以上の群で観察された.これらの病変分布は気管支の中でも末梢にあたる終末細気管支や呼吸細気管支には観察されず,むしろ小葉間気管支や気管などの上部気道で認められたこと,個体差があること,低用量でも少数例に発生することを特徴としていた.なお,NTPで行われたトリレンジイソシアナートのF344ラットを用いた13週間の強制経口投与試験ではmucoid bronchopneumoniaの発生が報告されており6),さらにヒトでは経気道曝露により喘息などを引き起こすことが知られている7)が,CDラットに4週間の経口投与を行った本試験ではそれらに関連する所見は観察されなかった.気管および気管支上皮に認められた変化は気道の末梢部には認められないことから,咽頭部を介した被験物質あるいはその分解産物による直接刺激性の障害像と考えられる.また,腺胃のびらんが300 mg/kg群の雌雄の各1例に観察されているが,被験物質が粘膜刺激性を有する物質であることから,発生数は少ないながらも被験物質の直接的な影響の可能性も考えられる.一方,肝臓の脂肪化は雌雄ともに300 mg/kg群で発生数の減少を示したが,肝細胞の肥大や退行性変化などは認められず,機能的変化と考えられた.脾臓を除く肺,気管,胃,小腸および肝臓でみられた被験物質の影響を示唆する所見は回復期間終了時にはいずれも観察されず可逆性変化であることが示唆された.その他観察された諸変化は自然発生病変と考えられる.

以上の結果,トリレンジイソシアナートの標的器官は脾臓,肺,気管,胃,小腸および肝臓と判断された.30 mg/kg群では雌雄とも無影響量が確認できなかったため,NOELは雌雄とも30 mg/kg未満と判断された.

文献

1)佐野正樹,岡山佳弘,医薬安全性研究会会報32,21(1990).
2)M. Yoshida, J. Jap. Soc. Comp. Stat. 1, 111(1988).
3)倍味繁,稲葉太一,医薬安全性研究会会報,40, 33(1994).
4)A. L. Kennedy, M. F. Stock, et al., Toxicol Appl Pharmacol, 100, 2, 280(1989).
5)C. Timchalk, F. A. Smith and M. J. Bartels, Toxicol Appl Pharmacol, 124, 181(1994).
6)U. S. Department of health and human services, Public health service, “National Toxicology Program Technical Report Series,” No.251, National Institutes of Health, 1986, pp.1-194.
7)H. Weil, B. Butcher, V. Dharmarajan, H. Glindmeyer, R. Jones, J. Carr, C. O'Neill, J. Salvaggio, Respiratory and immunologic evaluation of isocyanate exposure in a new manufacturing plant. DHHS(NIOSH)Publication No.81-125, Division of Respiratory Disease Studies, Morgantown, W. Va. 1981.

連絡先
試験責任者:大庭耕輔
試験担当者:各務 進,伊賀達也,向井大輔,山川誠己,大橋信之
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
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Correspondence
Authors:Kousuke Oba(Study director)
Susumu Kakamu, Tatsuya Iga, Daisuke Mukai, Seiki Yamakawa, Nobuyuki Oohashi
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582-2 Arahama, Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
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