2-ナフトールのマウスを用いる小核試験

Micronucleus Test of 2-Naphthol in Mice

要約

 2-ナフトールについて,マウスを用いる小核試験を実施した.

 用量設定試験結果をもとに,BDF1系雄マウスに62.5,125および250 mg/kgの3用量を1日1回2日間連続して強制経口投与し,最終投与後24時間に骨髄塗抹標本を作製し,検鏡することにより小核誘発性を検討した. 

 2-ナフトール投与による小核を有する多染性赤血球の誘発傾向は認められなかった.また観察全赤血球中の多染性赤血球の割合については,明確な減少傾向は認められなかった.
以上の結果より,本試験条件下では2-ナフトールは,小核を誘起しない(陰性)と結論した.

方法

1. 試験動物

 試験には,日本エスエルシーから購入した8週齢のBDF1系マウス(C57BL/6 × DBA/2,SPF)を,7日間検疫と馴化を兼ねて飼育した後,9週齢で試験に供した.

 温度24.5 ± 2.5℃,湿度55 ± 20 %,換気回数1時間あたり18回,照明12時間(午前7時点灯,午後7時消灯)に設定した飼育室で動物を飼育した.床敷きとして,アルファドライ(Shepherd Specialty Papers)を入れたzyfone製飼育ケージに,検疫期間中は2匹,群分け後は2〜3匹ずつ収容し,固型飼料(MF,オリエンタル酵母工業)と水道水(磐田市上水道給水)を自由に摂取させた.

2. 被験物質

 被験物質の2-ナフトール(ロット番号:DB1991)は純度99.5 %の白〜灰色のフレーク状固体である.本剤は水に0.08 g/L(25℃)可溶,アルコール,エーテル,クロロホルム,ベンゼンに可溶である.上野製薬(大阪)から提供された被験物質を使用した.被験物質は,使用時まで冷暗所に密閉して保管した.試験終了後,被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果,安定性に問題はなかった.

3. 被験物質液の調製

 被験物質を0.5 w/v%メチルセルロース溶液(0.5 w/v% MC,400 cP溶液,和光純薬工業)に懸濁させ,調製原液とした.調製原液を使用媒体を用いて順次所定濃度に希釈し,速やかに投与に用いた.各調製液は,投与初日ならびに投与2日目の用時に調製した.

4. 試験用量および試験群の設定

 62.5〜1000 mg/kgの5用量(公比2)を用い,雄雌両性のマウスを用いて用量設定試験を実施した.その結果,雄では初回投与後18時間以内に1000 mg/kgで3匹全例,500 mg/kgで3匹中2例の死亡が認められた.雌では初回投与後4時間以内に1000 mg/kgで,また初回投与後18時間以内に500 mg/kgで3匹全例の死亡が,初回投与後24時間以内に250 mg/kgで3匹中1例の死亡が認められた.雄雌とも250 mg/kgで2 g以上の体重減少が観察された.また,初回投与後0.5時間から毒性兆候が認められ,2回目投与後0.5,1および4時間に自発運動減少および体温低下が2例に認められた.

 以上の結果から,小核試験では毒性兆候が認められる用量付近の250 mg/kgを最高用量とし,以下125および62.5 mg/kg(公比2)の3用量および陰性対照群を設定した.また,雄雌の毒性発現に顕著な差が認められなかったため小核試験は雄のみで実施することとした.

 なお,陽性対照として,マイトマイシンC(MMC,協和醗酵工業)を0.5 mg/kgの用量で試験した.

5. 投与方法および投与回数

 250 mg/kg群では8匹に,その他の試験群では6匹に投与し,そのうちの5匹を評価に使用した.

 被験物質の投与経路は経口とし,ディスポーザブルシリンジとテフロン製ゾンデを用いて1日1回,24時間間隔で2日間連続投与した.陽性対照物質の場合は腹腔内投与とし,マイクロシリンジと25G注射針を用いて1回投与した.

 投与容量は体重10 g当たり0.1 mLとし,群分け時の体重から投与液量(mL)を求めた.

6. 体重測定および一般状態観察

 用量設定試験では,動物搬入時,検疫期間終了時(群分け時)および最終投与後24時間に電子天秤(PG802-S,Mettler Toledo AG)を用いて体重を測定した.また,死亡動物については死亡発見時に体重を測定した.初回投与後0.5,1,4,18および24時間ならびに最終投与後0.5,1,4,18および24時間に動物の一般状態を観察した後,各用量の最終投与後24時間での死亡率を求めた.

 小核試験では,動物搬入時,検疫期間終了時(群分け時)および標本作製直前に電子天秤PG802-SあるいはPG2002(Mettler Toledo AG)を用いて体重を測定した.また,死亡動物については死亡発見時に体重を測定した.陰性対照および被験物質投与群については,初回投与後1,4,21,24時間,最終投与後1,4,21時間ならびに標本作製時に,陽性対照群については,投与後1,4,21時間ならびに標本作製時に動物の一般状態を観察した.

7. 骨髄塗抹標本の作製

 Schmidの方法 1, 2)に従い,骨髄塗抹標本を作製した.最終投与後24時間(陽性対照群は投与後24時間)に動物を炭酸ガス吸入法で安楽死させた.大腿骨を摘出し少量の非働化(56℃,30分)済みウシ胎児血清(Invitrogen)を用いて骨髄細胞を洗い出し,遠心分離法により余剰血清を除いた後,各動物につき3枚の塗抹標本を作製した.十分に乾燥させた塗抹標本をメタノールで固定した後,各動物につき2枚の塗抹標本を3 %ギムザ液(Merck)で30分間染色した.0.01 mol/L ナトリウム・リン酸緩衝液(pH 6.8,Merck)および精製水で洗浄し,乾燥させた.さらに0.01 %クエン酸水溶液および精製水で洗浄した後,再び乾燥させた.生存動物全例について骨髄塗抹標本を作製した.

8. 小核多染性赤血球の観察

 全ての標本をコード化した後,小核を観察した.

 動物1匹当たり2000個の多染性赤血球(polychromatic erythrocyte:PCE)を顕微鏡下(×1000程度)で観察した.小核を有する多染性赤血球(micronucleated polychromatic erythrocyte:MNPCE)数を計測するとともに,骨髄に対する影響を調べるため全赤血球500個中の多染性赤血球数についても計測した.

 小核の出現頻度は,小核を有する多染性赤血球数を観察した多染性赤血球数で割ることにより算出した.全赤血球に対する多染性赤血球の割合は,多染性赤血球数を観察した赤血球数で割ることにより算出した.

9. 結果の解析

 各試験群の小核多染性赤血球の出現頻度は陰性対照群と他の群(陽性対照群を含む)において,条件付き二項検定(Kastenbaum and Bowmanの推計学的方法:有意水準上側0.025)を行った.

 観察赤血球中の多染性赤血球の割合は,陰性対照群と他の群(陽性対照群を含まない)においてDunnettの多重比較(有意水準両側0.05)を行い,陰性対照群と陽性対照群においてはAspin-Welchのt検定(有意水準両側0.05)を実施した.

 陰性対照群と比較し,被験物質処理群あるいは陽性対照群において統計学的な有意差が認められた場合,陽性と判定した.

結果および考察

 小核試験の結果をTable 1に示した.2-ナフトール投与により,250 mg/kgで初回投与後21時間に1例の死亡が認められた.なお,250 mg/kgにおいては初回投与後1時間から自発運動減少等の毒性兆候が認められ,平均値で3 gの体重減少もみられた.個体別に多染性赤血球2000個を観察した結果,陰性対照群での小核(MNPCE)の出現頻度は0.18 %であった.また,観察全赤血球中における多染性赤血球の割合(PCE比)は57.6 %であった.2-ナフトール投与によるMNPCEの出現頻度は,62.5 mg/kg群で0.27 %,125 mg/kg群で0.22 %および250 mg/kg群で0.29 %であり,陰性対照群と比較して統計学的に有意な増加は認められなかった.また,被験物質の骨髄細胞に対する影響の指標であるPCE比は,62.5,125および250 mg/kg群でそれぞれ54.6,54.8および48.7 %であり,陰性対照群と比較して有意な減少は認められなかった.

 一方,MMCを投与した陽性対照群ではMNPCEの出現頻度は1.18 %と明確に増加し,陰性対照群に比べ統計学的に有意(p<0.025)な増加を示した.さらに,PCE比は54.0 %であった.

 以上の試験結果から,本試験条件下において2-ナフトールのマウスに対する小核の誘発性は陰性と判定された.このことより,本物質の染色体構造異常ないし数的異常誘発性はないものと推定された. 

 なお,本被験物質(2-ナフトール)について,S. typhimuriumを用いる復帰突然変異試験で陰性 3),DNA修復試験では,Bacillus subtilisを用いた場合には陰性 3),E. coliを用いた場合には陽性 3),発がん性については陰性 3)と報告されている.

 類縁体であるナフタレン(Naphthalene),a-ナフチルアミン(a-Naphtylamine)はCHL細胞を用いた染色体異常試験で陽性 4),2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウム(Sodium 2-naphthol-3,6-disulfonate)は細菌を用いる復帰変異試験 5)およびCHL細胞を用いた染色体異常試験で陰性 6)との報告があった.

文献

1) Schmid W:The micronucleus test. Mutation Res, 31:9-15(1975).
2) Schmid W:The micronucleus test for cytogenetic analysis. In “Chemical Mutagens”, Vol. 4, Holla-ender A(ed.), Plenum press, New York(1976)pp. 31-53.
3) Stuter W, Jaeger I:Comparative evaluation of different pairs of DNA repair-deficient and DNA repair-proficient bacterial tester strains for rapid detection of chemical mutagens and carcinogens. Mutation Res, 97(1):1-18(1982).
4) 祖父尼俊雄(監修):「染色体異常試験データ集〈改訂1998年版〉」エル・アイ・シー,東京(1999)p.348.
5) 野田篤ら:2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムの細菌を用いる復帰変異試験.化学物質毒性試験報告,6:372-375(1998).
6) 野田篤ら:2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験.化学物質毒性試験報告,6:376-379 (1998).

連絡先
試験責任者: 益森勝志
試験担当者: 古屋有佳子,柴本美恵子,木下裕加,
鈴木ゆみ子,上田摩弥,尾h伸也,
赤星まゆみ,仲村渠奈美子,
岩倉佳奈子,萩原弘美,鈴木雅也
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213 静岡県磐田市塩新田582-2
Tel 0538-58-1266 Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors: Shoji Masumori (Study director)
Yukako Furuya, Mieko Shibamoto,
Yuka Kishita, Yumiko Suzuki,
Maya Ueda, Shin-ya Ozaki,
Mayumi Akahoshi,
Namiko Nakandakari,
Kanako Iwakura, Hiromi Hagiwara,
Masaya Suzuki
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden, Iwata-shi, Shizuoka, 437-1213, Japan
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