リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルのラットを用いる
28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
Diphenyl 2-ethylhexyl phosphate in Rats

要約

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルは，リン酸エステル系の可塑剤である1)．今回，既存化学物質の安全性点検に係わる毒性調査事業の一環として，リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルを0，4，20，100および500 mg/kgの用量でSD系ラットの雌雄に28日間反復経口投与し，その毒性について検討した．対照群，100および500 mg/kg群については14日間回復群を設けた．

摂餌量の低値が500 mg/kg群の雌で認められた．血液学検査では，活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が500 mg/kg群の雌で認められた．血液生化学検査では，血漿コリンエステラーゼの低値が500 mg/kg群の雌雄，血球コリンエステラーゼの低値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄，総コレステロールの高値が500 mg/kg群の雌，総タンパクの高値が100 mg/kg群の雄と500 mg/kg群の雌雄，アルブミンの高値が100 および500 mg/kg群の雄，GOT の低値が500 mg/kg群の雌，アルカリフォスファターゼの低値が100 および500 mg/kg群の雌で認められた．尿検査では，異常は認められなかった．病理学検査では，肝臓の変化として相対重量の高値が100 mg/kg群の雄，絶対重量および相対重量の高値が500 mg/kg群の雌雄，褐色化が100 および500 mg/kg群の雌雄，腫大が500 mg/kg群の雌雄，小葉中心性の肝細胞肥大が100および500 mg/kg群の雌雄で認められた．腎臓の変化として，近位尿細管上皮内の硝子滴の増強が500 mg/kg群の雄で認められ，一部の動物では好酸性小体の発現も伴われていた．甲状腺の変化として，腫大が100 mg/kg群の雄と500 mg/kg群の雌雄，ろ胞上皮細胞の肥大が100 および500 mg/kg群の雌雄で認められた．副腎の変化として，絶対重量と相対重量の高値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄，腫大が100 および500 mg/kg群の雌雄，束状帯の脂肪滴の増加が500 mg/kg群の雌雄で認められた．これらの変化は，投与を止めることにより軽減ないし回復していた．20 mg/kg 群では雌雄いずれも被験物質に起因した変化は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下におけるリン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルの無影響量は雌雄いずれも20 mg/kg/day であると判断した．

方法

1．被験物質

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステル(大八化学工業(株)，製品名♯41，CAS No. 1241-94-7，Lot No. K70801，純度91.4％)は，凝固点-54℃，融点239℃/13.3 hPa，油溶性の無色透明液体である．本ロットは投与期間中安定であることが確認された．投与液は被験物質を0.1%Tween 80水溶液に乳化させ調製し，冷蔵保存した．投与液中の被験物質は冷蔵保存条件下で8日間安定であり，使用した投与液にはほぼ所定量の被験物質が均一に含有されていることを確認した．

2．試験動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)より入手したSD系ラット(Crj:CD，SPF)の雌雄を7〜8日間検疫・馴化し，試験に使用した．投与開始前日に体重別層化無作為抽出法により群分けした．1群の動物数は雌雄各6匹とし，対照群，100および500 mg/kg 群については雌雄各6匹の14日間回復群を設けた．投与開始時の週齢は5週齢，体重範囲は雄が156〜177 g，雌が 137〜158 gであった．

検疫・馴化期間を含めた全飼育期間中，温度20〜25℃，湿度40〜70％，換気約12回／時，照明12時間(7:00〜19:00)に自動調節された飼育室を使用した．動物は，実験動物用床敷(ベータチップ:日本チャールス・リバー(株))を敷いたポリカーボネート製ケージに1ケージあたり2匹で収容し飼育した．

動物には，実験動物用固型飼料(MF:オリエンタル酵母工業(株))および5μmのフィルター濾過後，紫外線照射した水道水を，それぞれ自由に摂取させた．

3．投与量および投与方法

被験物質を0，100，500および1000 mg/kgの各用量でSD系ラットに14日間反復経口投与した結果，全投与群で流涎が発現し，体重増加抑制とヘモグロビン濃度およびヘマトクリット値の低値が1000 mg/kg群の雄で認められた．また，肝臓の絶対重量および相対重量の高値が全投与群の雌雄で認められ，1000 mg/kg群の雌雄では肝肥大が顕著であった．その他，副腎の絶対重量および相対重量の高値が500 mg/kg以上の投与群の雌，副腎の相対重量の高値が1000 mg/kg 群の雄，腎臓の相対重量の高値が1000 mg/kg 群の雌雄で認められた．従って，本試験では高用量を 500 mg/kg とし，以下公比5で中間量を100および20 mg/kg，低用量を4 mg/kg とした．被験物質は28日間毎日1回，午前中に胃ゾンデを用いて強制経口投与した．投与液量は10 mL/kgとし，至近測定日の体重を基に算出した．対照群には同様に溶媒を投与した．

4．観察および検査方法

1)　一般状態， 体重および摂餌量

全例について一般状態を毎日観察した．体重および摂餌量は投与開始日およびその後週1回測定した．摂餌量については，各期間毎の1匹あたりの1日平均摂取量を算出した．

2)　血液学検査

各計画殺時の全例について，チオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で後大静脈より採血し，赤血球数(シースフローDCインピーダンス検出法)，白血球数(RF/DCインピーダンス検出法)，血小板数(シースフローDCインピーダンス検出法)，ヘモグロビン濃度(SLSヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(赤血球パルス波高値検出法)を多項目自動血球分析装置(NE-4500:東亞医用電子)，白血球百分率(Wright染色塗抹標本)を血液細胞自動分析装置(MICROX HEG-70A:立石電機)，網状赤血球数(アルゴンレーザーを用いたフローサイトメトリー法)を自動網赤血球測定装置(R-2000:東亞医用電子)，プロトロンビン時間(PT；Quick一段法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT；活性化セファロプラスチン法)を血液凝固自動測定装置(KC10A:アメルング社)により測定した．また，検査の結果から平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)，平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．凝固阻止剤として，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間測定には3.13%クエン酸ナトリウム水溶液を，それ以外の項目の測定にはEDTA-2Kを用いた．

3)　血液生化学検査

採取した血液の一部をヘパリン(リチウム塩)処理後，3000 r.p.m.，10分間遠心分離し，得られた血漿を用いてGOT(SSCC改良法)，GPT(SSCC改良法)，ALP(GSCC改良法)，γ-GTP(SSCC改良法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，グルコース(GK-G6PDH法)，総コレステロール(CES-CO-POD法)，トリグリセライド(LPL-GK-G3PO-POD法)，クレアチニン(Jaff法)，総蛋白(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白およびアルブミンより算出)，カルシウム(O-CPC法)，無機リン(UV法)，ナトリウム，カリウム，クロール(イオン選択電極法)を自動分析装置(日立736-10形:(株)日立製作所)により測定した．

全例の血漿コリンエステラーゼ(アセチルチオコリン-DTNB法)を自動分析装置(日立736-10形:(株)日立製作所)，血球コリンエステラーゼ(アセチルチオコリン-DTNB法)を自記分光光度計(日立U-3200形:(株)日立製作所)および脳コリンエステラーゼ(アセチルチオコリン-DTNB法)を自動分析装置(COBAS FARA:F．Hoffmann La Roche & Co.)により測定した．

4)　尿検査

雄は投与開始後26日，雌は投与開始後25日に各群雌雄6匹の新鮮尿を採取して，pH，潜血，蛋白，糖，ケトン体，ビリルビン，ウロビリノーゲン(試験紙法，マルティスティックス，マイルス・三共(株))を尿分析器(クリニテック100:マイルス・三共(株))により測定した．

5)　病理学検査

全例について採血後に腹大動脈を切断して放血致死させ剖検した．剖検後，全例の脳，肝臓，腎臓，副腎，胸腺，脾臓，甲状腺(上皮小体を含む)，精巣および卵巣の重量を測定した．また，全例の上記器官に加え，下垂体，眼球，ハーダー腺，肺，胃，心臓，膀胱，骨髄(大腿骨)，坐骨神経，脊髄を採取し，10%中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定，保存した．ただし，眼球およびハーダー腺はDavidson液で固定した．

投与期間終了時解剖動物の対照群および500 mg/kg群の雌雄の心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，脳，坐骨神経，脊髄，甲状腺，下垂体および全動物の肉眼的異常部位を対象に，常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し鏡検した．その結果，雌雄の肝臓，副腎，甲状腺と雄の腎臓に被験物質投与に起因すると考えられる変化が認められたため，投与期間終了時解剖動物の他の群と回復試験終了時解剖動物の当該器官(腎臓は雄のみ)を検査した．また，代表例の肝臓および副腎についてオイルレッドO染色と甲状腺の渡辺鍍銀染色を行い，鏡検した．

6)　統計解析

計量データについては，Bartlett法による等分散の検定を行い，分散が一様の場合は一元配置分散分析を行った後，Dunnett法またはScheff法により検定した．分散が一様でない場合はKruskal-Wallisの検定を行い，Dunnett型またはScheff型の順位和検定を行った．計数データおよび病理組織所見については，Armitageのχ^2検定を行った．有意水準は 5% 未満とした．

結果

1．一般状態

投与後の流涎が100 mg/kg群の雄で投与開始後6日以降，雌で投与開始後5日以降，500 mg/kg群の雄で投与開始後1日以降，雌で投与開始後4日以降に発現した．また，投与前の流涎が 100 mg/kg群の雌で投与開始後8日に，500 mg/kg群の雄で投与開始後7日以降，雌で投与開始後13日以降に発現した．投与後の流涎は，投与直後に発現する一過性の変化であり，投与前の流涎は動物の体に触れることにより発現した．回復期間にはこれらの変化は認められなかった．

2．体重(Fig. 1)

全試験期間を通じて，いずれの投与群も対照群と同様の体重推移を示した．

3．摂餌量

投与開始後3週に摂餌量の低値が500 mg/kg群の雌で認められた．回復期間には本変化は認められなかった．

4．血液学検査(Table 1)

投与期間終了時の検査で，活性化部分トロンボプラスチン(APTT)時間の延長が500 mg/kg群の雄で認められた．回復期間終了時の検査では，本変化は認められなかった．

なお，回復期間終了時の検査で網状赤血球数の低値が100 mg/kg群の雄で認められたが，軽微な変動であることやその発現状況から被験物質に起因した変化ではないと判断した．

5．血液生化学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査で，血漿コリンエステラーゼの低値が500 mg/kg群の雌雄，血球コリンエステラーゼの低値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．また，総コレステロールの高値が500 mg/kg群の雌，総タンパクの高値が100 mg/kg群の雄と500 mg/kg群の雌雄，アルブミンの高値が100 および500 mg/kg群の雄で認められた．さらにGOT の低値が500 mg/kg群の雌，アルカリフォスファターゼの低値が100 および500 mg/kg群の雌で認められた．回復期間終了時の検査では，これらの変化のうち血漿コリンエステラーゼの低値が100 および500 mg/kg群の雌，血球コリンエステラーゼの低値が500 mg/kg群の雌雄で認められたが，いずれもその程度は軽減していた．

なお，回復期間終了時の検査で A/G比と無機リンの高値が500 mg/kg群の雄で認められたが，いずれも軽微な変動であることやその発現状況から被験物質に起因した変化ではないと判断した．

6．尿検査

投与期間中の検査において，いずれの投与群にも異常は認められなかった．

7．器官重量(Table 3)

投与期間終了時の検査で，肝臓の相対重量の高値が100 mg/kg群の雄，絶対重量と相対重量の高値が 500 mg/kg 群の雌雄で認められた．また，副腎の絶対重量と相対重量の高値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．回復期間終了時の検査では，これらの変化のうち肝臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌で認められたが，その程度は軽減していた．また，甲状腺の絶対重量および相対重量の高値が500 mg/kg群の雄で認められた．

8．剖検所見(Table 4)

投与期間終了時の検査で，肝臓の褐色化が100 mg/kg群の雄4例，雌6例と500 mg/kg群の雄5例，雌6例に，腫大が500 mg/kg群の雌雄全例に認められた．回復期間終了時の検査では，上記変化のうち肝臓の腫大が500 mg/kg群の雌2例に認められた．なお，肝臓の腫大は100 mg/kg 群の雄1例と4 mg/kg群の雌1例にも認められたが，いずれも遺伝性疾患である'Polycystic disease'に伴う変化であり，被験物質に起因した変化ではないと判断した．甲状腺の腫大が100 mg/kg群の雄1例と500 mg/kg群の雄3例，雌2例に認められた．回復期間終了時の検査では，本変化が500 mg/kg群の雌2例に認められた．副腎の腫大が100 mg/kg群の雄2例，雌1例と500 mg/kg群の雄5例，雌6例に認められた．腫大した副腎は全体に白色調を呈していた．回復期間終了時の検査では，本変化は認められなかった．

その他，被験物質投与群に種々の変化が認められたが，その発現状況からいずれも被験物質に起因した変化ではないと判断した．

9．病理組織所見(Table 5)

投与期間終了時解剖動物の検査で，肝臓の小葉中心性の肝細胞肥大が100 mg/kg群の雄2例，雌4例と500 mg/kg群の雌雄全例に認められた．肥大した肝細胞は好酸性を増し，くもり硝子様変化を呈した．雄では肥大した肝細胞内にオイルレッドO染色陰性の空胞が増加する例もみられた．回復期間終了時解剖動物の検査では，肝細胞肥大が100 mg/kg群の雌1例と500 mg/kg群の雌2例に認められたが，その程度は軽減していた．腎臓の近位尿細管上皮の硝子滴の増加が500 mg/kg群の雄4例で認められ，そのうち1例では近位尿細管上皮内の好酸性小体の出現も伴われていた．回復期間終了時解剖動物の検査では，近位尿細管上皮内の硝子滴の程度の増強が 500 mg/kg群の雄2例，近位尿細管上皮内の好酸性小体が500 mg/kg群の雄4例，程度の強い好塩基性尿細管が500 mg/kg群の雄1例で認められた．甲状腺のろ胞上皮細胞の肥大が100 mg/kg群の雌雄各2例と500 mg/kgの雄6例，雌5例に認められた．回復期間終了時解剖動物の検査でも，ろ胞上皮細胞の肥大が100 mg/kg群の雄2例と500 mg/kg群の雄3例，雌1例に認められた．副腎の束状帯の脂肪滴の増加が500 mg/kg群の雌雄全例に認められた．雄では大小様々な脂肪滴，雌では小型で均一な脂肪滴が出現していた．回復期間終了時解剖動物の検査では，本変化は認められなかった．

その他，被験物質投与群で種々の変化が認められたが，その発現状況からいずれも被験物質に起因した変化ではないと判断した．

考察

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルを0，4，20，100，500 mg/kgの用量でSD系ラットの雌雄に28日間反復経口投与し，その毒性を検討した．

一般症状として，投与前後の流涎が100および500 mg/kg群の雌雄で認められた．しかし，投与後の流涎は投与直後に発現する一過性の変化であり，投与前の流涎は動物の体に触れることによって発現する条件反射的な変化であることや，これらの変化は投与を止めることにより発現しないことから，被験物質の味等に起因した変化であり，毒性学的意義はないと判断した．従って，流涎は無影響量の評価の対象からは除外した．

体重に変化はみられなかったが，摂餌量の低値が500 mg/kg群の雌で認められた．本変化は投与を止めることにより回復した．

血液学検査で，活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が500 mg/kg群の雄で認められた．しかし，軽微な変化であることやプロトロンビン時間に異常がないことや肝傷害性の変化がないことなどから本変化の毒性学的意義は低いと思われる．本変化は投与を止めることにより回復した．

血液生化学検査で，血漿あるいは血球コリンエステラーゼの低値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．被験物質はコリンエステラーゼ活性の阻害作用を有することが知られている有機リン化合物の一種であることから，同様のコリンエステラーゼ活性の阻害が惹起されたものと思われる．また，総コレステロール，総蛋白あるいはアルブミンの高値が100 mg/kg群の雄と500 mg/kg群の雌雄で認められたが，これらの変化はコリンエステラーゼ活性阻害に伴い代償性に肝臓でのタンパク質や脂質の合成が亢進した結果生じたものと思われる．回復期間終了時には，上記変化のうち血漿あるいは血球コリンエステラーゼの低値が100および500 mg/kg群で認められたが，その程度は明らかに軽減していた．なお，投与期間終了時にGOTの低値が500 mg/kg群の雌，アルカリフォスファターゼの低値が100および500 mg/kg群の雌で認められたが，一般的に問題となる値の上昇ではなく，減少であることから毒性学的には意義の乏しい変化と思われる．

病理学検査では，肝臓の絶対重量あるいは相対重量の増加が100 mg/kg群の雄と500 mg/kg群の雌雄，褐色化が100および500 mg/kg群の雌雄，小葉中心性の肝細胞肥大が500 mg/kg群の雌雄で認められた．小葉中心性の肝細胞肥大はくもり硝子様変化を特徴としており，これらの肝肥大性の変化は薬物代謝酵素誘導によるものと思われる．腎臓の近位尿細管上皮の硝子滴の増強が500 mg/kg群の雄で認められた．近位尿細管上皮の硝子滴はα2uグロブリンを含む蛋白の再吸収像であり，正常な成熟ラットでしばしばみられる変化である．そして，種々の化学物質投与により硝子滴の増数を特徴としたα2uグロブリン腎症が雄ラットに特異的に発現することが知られている2,3)．被験物質投与により同様のα2uグロブリン腎症が惹起されたものと思われる．また，近位尿細管上皮の好酸性小体あるいは好塩基性尿細管は硝子滴の過剰な蓄積に伴う変化と思われる．甲状腺の腫大が 100 mg/kg 群の雄と500 mg/kg群の雌雄，ろ胞上皮細胞の肥大が100 および500 mg/kg群の雌雄で認められた．薬物代謝酵素誘導を起こす化学物質は，肝臓での甲状腺ホルモンの代謝を促進し，二次的に視床下部-下垂体系を介して甲状腺ろ胞上皮細胞の肥大を惹起することが知られている4,5)．前述のように本試験でも薬物代謝酵素誘導の発現を示唆する肝肥大が認められることから，同様の機序でろ胞上皮細胞の肥大が生じた可能性が考えられる．一方，被験物質の甲状腺への直接作用の可能性も考えられるが，本試験の結果のみからでは明らかにはできなかった．副腎の絶対重量および相対重量の高値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄，腫大が100および500 mg/kg群の雌雄，束状帯の脂肪滴の増加が500 mg/kg群の雌雄で認められた．束状帯の脂肪滴の増加は，ステロイド合成阻害によって発現する脂質増生(lipid hyperplasia)の組織像と類似していた6)．回復期間終了後解剖動物では，これらの変化は回復あるいは軽減していた．

なお，被験物質は有機リン化合物であり，ネコおよびサルに運動神経麻痺と脊髄の脱髄を起こすことが知られているトリフェニルフォスフェートが不純物として含まれている7,8)．しかし，本試験では神経症状や中枢神経系の病理組織変化は認められなかった．

これらの試験結果から，本試験条件下におけるリン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルの無影響量は雌雄いずれも20 mg/kg/dayと結論した．

文献

1)化学工業日報社編，“12093 の化学商品,”化学工業日報社，東京，1993，pp．911-914.
2)C.L. Alden, C.H. Frith, "Handbook of Toxicologic Pathology," eds. by W. M. Haschek, C.G. Rousseaux, Academic Press, San Diego, 1991, pp.340-342.
3)P. Greaves, "Histopathology of Preclinical Toxicity Studies," ed．by P. Greaves, Interpretation and Relevance in Drug Safety Evaluation, Elsevier, Amsterdam, 1990, pp.532-538.
4)C.C. Capen, R.A. DeLellis, and J.T. Yarrington, "Handbook of Toxicologic Pathology," eds．by W.M. Haschek, C.G. Rousseaux, Academic Press, San Diego, 1991, pp.723-725.
5)G.O. Lumb and J.H. Rust, Toxicol. Pathol. 13, 315 (1985).
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8)D. Tanaka, S.J. Bursian, E.J. Lehning and R.J. Aulerich, Brain Research, 531, 294(1990).

連絡先
試験責任者：須藤雅人
試験担当者：清水優子，土谷　稔，勝田　修，豊田直人，
高野克代
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-02　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Masato Sudo(Study director)
Yuko Shimizu，Minoru Tsuchitani，Osamu Katsuta，Naoto Toyota,Katsuyo Takano
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874