4-メトキシベンズアルデヒドのラットを用いる
反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験

Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test
of 4-Methoxybenzaldehyde by Oral Administration in Rats

要約

4-メトキシベンズアルデヒドは,香料や化粧石鹸の原材料として使用されるほか1),日焼け防止を目的とするUV-Bブロッカーであるエチル-2-ヘキシル-メトキシ-シンニメイト等の化学物質の原料として,近年需要が増加している2, 3).このたび,この物質の反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験を行い,親動物に対する反復投与毒性および生殖能力ならびに次世代児の発生・発育に及ぼす影響について検討した.すなわち,Sprague-Dawley系(Crj:CD(SD)IGS)ラットの雌雄(各13匹/群)に,4-メトキシベンズアルデヒドの0(媒体),20,100および500 mg/kgを交配前2週間ならびに交配期間2週間を通して経口投与し,さらに雄では交配期間終了後2週間,雌では妊娠期間を通して分娩後哺育4日まで投与した.試験結果は以下のように要約される.

1. 反復投与毒性

雌雄ともに,いずれの投与群においても死亡あるいは瀕死動物は認められなかった.投与後には一過性の流涎が500 mg/kg投与群の雌雄で認められ,雌雄の100 mg/kg以上の投与群においては体重の増加傾向が,雄の100 mg/kg以上の投与群,雌の500 mg/kg投与群においては摂餌量の増加が,それぞれみられた.また,雄においては500 mg/kg投与群で,雌においては100 mg/kg以上の投与群で,それぞれ血小板数の有意な減少が認められた.

剖検の結果,500 mg/kg投与群の雌雄で腺胃粘膜に黒色の点あるいは領域,黒色物の付着がみられ,雌の100 mg/kg投与群において少数例で前胃粘膜の肥厚,水腫ならびに腺胃粘膜の黒色点が認められた.病理組織学検査の結果,雄の500 mg/kg投与群,雌の100 mg/kg以上の投与群では前胃に扁平上皮の過形成が認められた.

500 mg/kg投与群においては,雌雄とも肝臓重量の増加が認められ,病理組織学検査の結果,小葉中心性の肝細胞肥大がみられた.また,血液生化学検査では,雄の500 mg/kg投与群においてA/G比,GOT活性ならびに無機リン濃度の増加が認められた.

2. 生殖発生毒性

性周期の観察結果に4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められず,全ての動物が交尾した.同居から交尾までに要した日数およびその間の発情回数には,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間で有意差は認められなかった.しかし,500 mg/kg投与群においては交尾はしたが不妊であった動物が増加し,受胎率が有意に減少した.また,産児数,分娩率および出産生児数が対照群と比較して有意に減少し,生児出産率は減少する傾向を示した.産児数,分娩率,出産生児数および哺育4日の生児数にも減少がみられた.500 mg/kg投与群において精巣上体重量の有意な減少が認められたが,精巣,精巣上体,精嚢,前立腺,子宮および卵巣の病理学所見には,精巣上体で結節が,卵巣では卵巣嚢水腫がそれぞれ1例観察された以外異常はみられなかった.また,分娩および哺育状態の異常は観察されず,出産率,妊娠期間,妊娠黄体数,着床数および着床率,出生児の体重,形態,性比および生後4日の生存率には4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められなかった.

3. 無作用量

以上の試験成績から本試験条件下では,4-メトキシベンズアルデヒドの反復投与毒性に関する無作用量は雌雄ともに20 mg/kg/day,生殖発生毒性に関する無作用量は雌雄とも100 mg/kg/day,出生児に対する無作用量も100 mg/kg/dayであると判断される.また,4-メトキシベンズアルデヒドの経口投与時の標的器官は胃ならびに肝臓であると推定される.

方法

1. 被験物質

本試験には,(株)日本触媒(神奈川)より提供された4-メトキシベンズアルデヒド(ロット番号:W81015,純度:99.9 %)を用いた.受領した4-メトキシベンズアルデヒドは,入手後,使用時まで気密容器に入れて室温で保管した.被験物質の試験期間中の安定性は,残余被験物質を提供元で再分析することにより確認した.

投与にあたっては,用量毎に4-メトキシベンズアルデヒドを秤量し,所定濃度となるようにコーン油(ナカライテスク(株),ロット番号:V8P7069)を加えて溶解した.試験中に調製した投与検体(0.40, 2.00, 10.0 w/v%)には,所定濃度の4-メトキシベンズアルデヒドが含有されていたことを確認した.なお,調製検体中の被験物質の安定性について確認した結果,0.4〜20 w/v%の濃度では室温,遮光の条件下で少なくとも8日間安定であった.

2. 使用動物および飼育条件

試験には,雌雄とも7週齢にて購入した日本チャールス・リバー(株)筑波飼育センター生産のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD(SD)IGS, SPF)を使用した.購入した動物は入荷後2週間,馴化と検疫を兼ねて予備飼育し,雄は検疫終了日の体重を基に,雌は規則的に4日あるいは5日で性周期を回帰している動物を選択し,さらに検疫終了日の体重を考慮して,それぞれ体重別層化無作為抽出法により群分けして,各群とも雌雄各13匹を配した.

各動物は,基準温度24 ± 1 ℃,基準湿度50〜65 %,換気回数約15回/時ならびに照明12時間(午前7時〜午後7時)に制御された飼育室で,金属製金網床ケージに個別に収容し,固型飼料(CE-2,日本クレア(株)および水道水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させた.妊娠14日(交尾確認日=妊娠0日)以後の雌動物については,プラスチック製ラット用繁殖ケージに収容し,床敷として紙パルプ製チップ(ALPHA-dri,加商(株)を適宜供給した.

3. 投与量の設定および投与方法

本試験の投与量は,予備試験の結果をもとに設定した.予備試験では,4-メトキシベンズアルデヒドの0(コーン油),250,500,1000 mg/kgを本試験と同系統の雌雄ラットに,1日1回,14日間強制的に連続経口投与した.その結果,一般状態では投与後の流涎が500 mg/kg以上の投与群の雌雄に認められ,1000 mg/kg投与群では雌雄で摂餌量の有意な抑制が,雄で体重増加の抑制傾向がそれぞれ認められた.血液学検査の結果,1000 mg/kg投与群の雌では血小板数が有意に減少した,血液生化学検査の結果,1000 mg/kg投与群では雄のアルカリフォスファターゼ活性ならびに雌雄のGPT活性の有意な増加,雌雄のGOT活性の増加傾向が認められ,4-メトキシベンズアルデヒド投与による肝臓に対する影響が疑われた.剖検の結果,胃粘膜面の肥厚,水腫,赤色調あるいは暗色点が1000 mg/kg投与群の雌雄,500 mg/kg投与群の雌ならびに250 mg/kg投与群の雄に認められた.また,器官重量測定の結果,肝臓重量の増加が絶対重量では雌雄の500 mg/kg以上の投与群で,相対重量では雄の500 mg/kg以上,雌の250 mg/kg以上の投与群でそれぞれ認められた.以上の予備試験の結果,4-メトキシベンズアルデヒドを14日間反復投与することにより,雌雄のいずれにおいても重量ならびにGOTやGPT活性の変化が認められたことから,肝臓に対して影響があるものと判断した.また,本試験での投与期間を考慮した場合,4-メトキシベンズアルデヒドの500 mg/kgの投与は死亡を発現させずかつ明らかな毒性を示す用量であると判断し,高用量を500 mg/kgに,以下公比5で除して100および20 mg/kgを中用量および低用量に設定した.

なお,対照群にはコーン油を4-メトキシベンズアルデヒド投与群と同一条件にて投与した.

各用量の投与検体は,雄に対しては交配前2週間と2週間の交配期間および交配期間終了後,剖検日前日まで2週間の連続42日間,また,雌に対しては交配前2週間と交尾が認められるまで最長2週間の交配期間,ならびに交尾した雌では妊娠期間を通して分娩の後,哺育4日(分娩日=哺育0日)まで,交尾はしたが分娩しなかった雌では妊娠24日相当日まで,毎日1回ラット用胃管を用いて経口投与した.毎日の投与は午前11時から午後2時の間に行い,各動物に投与する液量(体重1 kg当たり5 mL)は最新時の体重を基に算出した.

4. 観察および検査

1) 親動物

A. 一般状態の観察

雌雄とも全例について,飼育期間中毎日1回以上,投与期間中は投与前後の毎日2回以上観察した.

B. 体重測定

雄は全例について,投与1(投与初日),7,14,21,28,35,42日および解剖日に,雌は全例について,投与1,7,14日に測定し,交配までに期間を要した雌では,投与21ならびに28日にも体重を測定した.また,交尾した雌では,妊娠0,7,14,20日に,分娩した雌では哺育0,4日および解剖日に体重を測定した.交尾は確認されたが分娩しなかった雌は,妊娠25日相当日(解剖日)に体重を測定した.

C. 摂餌量測定

雄では投与1,7,13,29,35および41日に,雌では投与1,7および13日にそれぞれ給餌量を測定し,翌日までの摂餌量を測定した.2週間の交配期間中の摂餌量は測定しなかった.さらに,交尾した雌では妊娠0,7,14および20日に,分娩した雌では,哺育0および3日にそれぞれ翌日までの摂餌量を測定した.

D. 性周期

全例の雌について,交尾が確認されるまで腟垢塗抹標本を作製した.腟垢像より性周期を観察し,発情期の間の平均日数を算出した.

E. 交配

交配は,投与15日の夕方から最長2週間,同群内の雌雄を1対1で同居させて行った.交尾の確認は,毎朝,腟栓および腟垢標本中の精子の存在を調べることにより行い,交尾が確認された雌は,その日を妊娠0日と起算して雄から分離し,個別に飼育した.交配の結果から,各群について交尾率((交尾動物数/同居動物数)×100),受胎率((受胎動物数/交尾動物数)×100),同居開始から交尾までに要した日数およびその間に回帰した発情期の回数を求めた.

F. 分娩および哺育状態の観察

交尾を確認した雌は全例を自然分娩させた.分娩状態が直接観察できた動物についてはその状態を観察し,直接観察できなかった動物についても,分娩後の徴候から分娩困難や遅延などの分娩障害の有無を判断して記録した.分娩後は哺育状態を毎日観察した.

分娩の確認は午前9時〜11時に実施し,この時間帯に分娩が終了していることを確認した動物については,その日を分娩日と規定した.午前11時を過ぎてから分娩を終了した動物については,翌日を分娩日とした.

分娩を確認した全例について妊娠期間(妊娠0日から分娩日までの日数)を算定し,出産率((生児出産雌数/受胎動物数)×100)を各群について求めた.

G. 尿検査

各投与群の雌雄各5例について,投与6週に動物を代謝ケージに収容し約4時間尿あるいは新鮮尿を採取して,pH,潜血,蛋白,糖,ウロビリノーゲン,ケトン体,ビリルビンについて試験紙法(クリニテック200+,バイエル・三共(株)により,色調ならびに混濁度を視診により,それぞれ検査した.

H. 血液学検査

雄全例は投与42日の翌日に,分娩した雌は哺育4日の翌日に,交配したが分娩しなかった雌は妊娠25日相当日に,それぞれ前日より18から24時間絶食させた後,剖検に先立ちペントバルビタールナトリウム麻酔下で腹部後大静脈より採血し,以下の測定を行った.先ずクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採血し血漿を分離して,プロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間(光散乱検出法,CA-1000,東亜医用電子(株)を測定した.続いて,EDTA-2Kを抗凝固剤として採血し,Coulter Counter Model S-PLUS (コールターエレクトロニクス(株)により,赤血球数,白血球数,平均赤血球容積,血小板数(以上,電気抵抗法)および血色素量(吸光度法)を測定し,これらを基に平均赤血球血色素量,ヘマトクリット値および平均赤血球血色素濃度を算出した.血液の一部は塗抹標本とし白血球分類(Wright-Giemsa染色)を視算した.なお,対照群ならびに高用量群については,網状赤血球比率を測定した.

I. 血液生化学検査

血液学検査用の採血に引き続き,ヘパリンを抗凝固剤として採血し,血漿を分離して遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA,ロシュ・ダイアグノスティックス(株)を用いて総蛋白濃度(ビウレット法),アルブミン濃度(BCG法),総コレステロール濃度(COD・DAOS法),トリグリセライド濃度(GPO・DAOS法),ブドウ糖濃度(グルコキナーゼG6PDH法),尿素窒素濃度(ウレアーゼGl.DH法),クレアチニン濃度(Jaff法),アルカリフォスファターゼ活性(GSCC法),GOTおよびGPT活性(IFCC法),総ビリルビン濃度(Jendrassik/Grof法),カルシウム濃度(OCPC法),無機リン濃度(モリブデン酸直接法),γ-GTP活性(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法)を測定し,A/G比を算出した.また,全自動電解質分析装置(EA05,(株)A&T)により,塩素,ナトリウムおよびカリウムの各濃度(イオン電極法)を測定した.

J. 病理学検査

採血後,全例について剖検し,器官・組織の肉眼的観察を行った.その際,脳,心臓,胸腺,肝臓,腎臓,脾臓および副腎,雄ではさらに精巣および精巣上体の重量を測定し,併せて比体重値(相対重量)を算出した.雌では卵巣および子宮を摘出し,卵巣は実体顕微鏡下で妊娠黄体数を,子宮は着床数をそれぞれ数え,着床率((着床数/妊娠黄体数)×100)を算出した.全例の脳,下垂体,脊髄,消化管,肝臓,腎臓,副腎,脾臓,膵臓,心臓,胸腺,甲状腺,気管,肺,膀胱,腸間膜リンパ節,下顎リンパ節,坐骨神経,大腿骨髄および全ての雄動物の精嚢ならびに前立腺腹葉,全ての雌動物の腟,卵巣ならびに子宮は0.1 Mリン酸緩衝10 vol%ホルマリン液(pH 7.2)に固定した.肺は注入固定を行った.全ての雄動物の精巣および精巣上体はブアン液に固定して保存し,その後,長期保存のために0.1 Mリン酸緩衝10 vol%ホルマリン液に置換した.対照群および高用量群の雌雄各5例の固定した器官,ならびに残りの全ての雄動物の精巣および精巣上体,残りの全ての雌動物の卵巣,高用量群で不妊あるいは全胚吸収であった8例の子宮ならびに腟,これら不妊あるいは全胚吸収例の交尾相手の雄の精嚢および前立腺は,常法に従ってパラフィン切片とし,ヘマトキシリン-エオジン染色を行って,病理組織学検査を実施した.なお,高用量群の病理組織学検査の結果,変化が疑われた雌雄の肝臓および胃については全ての動物の,雄の心臓については雄全例の,該当器官についても病理組織学検査を実施した.

2) 出生児

A. 産児数の算定

哺育0日に産児数(生児+死亡児)を調べ,分娩率((産児数/着床痕数)×100)および生児出産率((出産生児数/着床痕数)×100)を求めた.また,産児については,外表奇形の有無および性別を調べ,性比((雄の生児数/雌の生児数)×100)を算出した.

B. 死亡児数の算定

死亡児数を毎日調べ,出生率((出産生児数/産児数)×100)および新生児の4日の生存率((哺育4日の生児数/哺育0日の生児数)×100)を求めた.死亡児は剖検し,異常の有無および内部器官の肉眼的観察を行った.

C. 体重測定

哺育0および4日に個別に体重を測定した.

D. 剖検

哺育4日に全例をエーテル吸入により致死させて剖検し,外表および内部器官の肉眼的観察を実施した.

5. 統計解析

交尾率ならびに受胎率についてはFisherの直接確率検定を行った.病理組織学検査所見のうち,グレード分けしたデータはMann-WhitneyのU検定により,陽性グレードの合計値はFisherの直接確率の片側検定により対照群との間で有意差検定を行った.その他の,体重,摂餌量ならびに定期解剖例の血液学,血液生化学検査の値および器官重量は,個体ごとに得られた値あるいはlitterごとの平均値を1標本として,Dunnett法による多重比較検定を行った.有意水準はいずれも5 %とした.

結果

1. 反復投与毒性

1) 一般状態

雌雄ともに,いずれの投与群においても死亡あるいは瀕死動物は認められなかった.投与後の一過性の流涎が500 mg/kg投与群の雄12例,雌11例で認められた.

2) 体重(Table 1, 2)

雄では100 mg/kg以上の投与群において増加傾向が投与初期から継続的にみられたが,対照群との間に有意差は認められなかった.

雌では500 mg/kg投与群においては投与初期から継続的に増加傾向がみられ,妊娠0ならびに7日には対照群に比較して有意に増加したが,妊娠14日以降の妊娠期間中の体重は個体差が著しく有意差は認められなかった.出産後,100 mg/kg以上の投与群の哺育0日の体重は対照群と比較して有意に増加し,500 mg/kg投与群の哺育4日の体重には,増加傾向が認められた.

3) 摂餌量(Table 3, 4)

雄では100 mg/kg投与群においては投与35日の,500 mg/kg投与群においては投与7日以降の摂餌量がそれぞれ有意に増加し,雌では500 mg/kg投与群において投与7および13日の摂餌量が有意に増加した.

4) 尿検査

雌雄とも尿検査結果に4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められなかった.

5) 血液学検査(Table 5, 6)

雄においては500 mg/kg投与群で,雌においては100 mg/kg以上の投与群で,それぞれ血小板数の有意な減少が認められた.

一方,雄においては100 mg/kg以上の投与群で赤血球数の有意な減少がみられ,雌においては100 mg/kg投与群で平均赤血球容積および平均赤血球血色素量の有意な増加がみられたが,雌雄ともヘマトクリット値や血色素量には著明な変化はみられないこと,認められた変化においても雌雄に共通するものでないこと,ならびに網状赤血球数の測定結果や骨髄,脾臓等の病理組織学検査結果にも血液学検査の変化に関連すると考えられる変化はみられないこと等から,赤血球系に関する変化はいずれも偶発的なものと考えられた.

6) 血液生化学検査(Table 7, 8)

雄の500 mg/kg投与群においては,A/G比,GOT活性ならびに無機リン濃度の有意な増加が認められた.一方,雌の100 mg/kg投与群においては,アルブミン濃度およびA/G比の減少ならびに塩素濃度の増加がみられたが,用量に依存した変化ではない事から,4-メトキシベンズアルデヒドの投与による影響ではないと判断した.雌の500 mg/kg投与群においては,ブドウ糖濃度の増加ならびにカルシウム濃度の減少がそれぞれ有意に認められた.

7) 病理学検査

A. 雄

イ. 肉眼所見

500 mg/kg投与群では腺胃粘膜に黒色点が,精巣上体に結節が各1例みられたほか,異常は認められなかった.その他,対照群の1例の肺に暗赤色点がみられた.

ロ. 器官重量(Table 9)

500 mg/kg投与群においては,肝臓の比体重値の有意な増加ならびに精巣上体の実重量および比体重値の有意な減少が認められた.

ハ. 病理組織学検査(Table 10)

精巣では,500 mg/kg投与群の精細管の間質に肉芽組織が,100 mg/kg投与群および対照群に精細管の萎縮がそれぞれ1例みられたが,500 mg/kg投与群においてみられた不妊(後述)の原因になったと考えられる異常は認められなかった.精巣上体では100 mg/kg投与群の1例の片側に精子肉芽腫が認められた.その他,前立腺では500 mg/kg投与群および対照群の間質にリンパ球浸潤がみられたが,両群間の発現頻度および程度に差は認められなかった.精嚢には異常はみられなかった.

胃では500 mg/kg投与群の全例,100 mg/kg投与群の3例の前胃に扁平上皮の過形成が認められた.その他,20 mg/kg投与群の1例の筋層にリンパ球および好中球の浸潤がみられた.

肝臓では500 mg/kg投与群の全例に小葉中心性の肝細胞肥大がみられた.また,各群のほとんどの例に門脈周囲性の肝細胞の脂肪化がみられたが,100 mg/kg以上の投与群では,対照群と比較して脂肪化の程度の強い例が減少していた.

心臓では,各群に心筋の変性/線維化がみられたが,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間で発現頻度および程度に明らかな差は認められなかった.

脾臓では,500 mg/kg投与群および対照群の全例に髄外造血および褐色色素の沈着がみられたが,両群間の発現頻度および程度に差は認められなかった.

その他,腎臓にはeosinophilic bodyや皮質に好塩基性尿細管が,肺には泡沫細胞の集簇がみられ,甲状腺には異所性の胸腺組織が,膵臓には腺房細胞の限局性の萎縮が認められた.観察した他の器官では異常は認められなかった.

B. 雌

イ. 肉眼所見

500 mg/kg投与群の腺胃粘膜には3例に暗色あるいは黒色の点や領域が,1例に黒色物の付着がみられた.また,100 mg/kg投与群の前胃粘膜には2例に肥厚が認められ,そのうち1例は水腫を伴っており,他の1例には腺胃粘膜に黒色点がみられた.

卵巣では500 mg/kg投与群で卵巣嚢水腫,100 mg/kg投与群で右側に嚢胞が,膣では100 mg/kg投与群の腔内で白色のゼラチン状内容物の貯留がそれぞれ1例みられたほか,異常は認められなかった.

その他,100 mg/kg投与群では肺に暗赤色点が,20 mg/kg投与群では肝臓に尾状葉の暗色化,回腸に憩室,腎臓の形態異常が,対照群には胸腺の小型化がみられた.

ロ.器官重量(Table 9)

500 mg/kg投与群においては絶食後体重の有意な増加が認められた.また,肝臓の実重量の有意な増加がみられたが,比体重値においては対照群との間に有意差は認められなかった.

ハ. 病理組織学検査(Table 10)

腟では対照群の1例の粘膜固有層に嚢胞がみられたが,500 mg/kg投与群における卵巣および子宮に,不妊(後述)の原因となったと考えられる異常は認められなかった.

胃では500 mg/kg投与群の全例,100 mg/kg投与群の5例の前胃に扁平上皮の過形成が認められ,500 mg/kg投与群の3例,100 mg/kg投与群の5例の粘膜下織に水腫がみられた.その他,水腫は20 mg/kg投与群および対照群の各1例にもみられたほか,100 mg/kg投与群および対照群の腺胃粘膜にリンパ球浸潤が観察された.

肝臓では500 mg/kg投与群の3例に小葉中心性の肝細胞肥大が認められた.その他,各群のほとんどの例に門脈周囲性の肝細胞の脂肪化がみられたが,各群間の発現頻度および程度に明らかな差は認められなかった.

腎臓では500 mg/kg投与群の2例,対照群の1例の皮質に好塩基性尿細管がみられ,そのうち500 mg/kg投与群の1例は他の例に比較して程度が強く,近位尿細管に空胞変性も観察されたが,500 mg/kg投与群の他の例に同様の変化は認められなかった.

脾臓では,500 mg/kg投与群および対照群の全例に髄外造血および褐色色素の沈着がみられたが,両群間の頻度および程度に差は認められなかった.

その他,肺には泡沫細胞の集簇が,甲状腺には異所性の胸腺組織がみられた.他の観察した器官では異常は認められなかった.

2. 生殖発生毒性

1) 親動物

A. 性周期(Table 11)

性周期の観察結果に4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められなかった.

B. 交配成績(Table 11)

全ての動物が交尾した.

同居から交尾までに要した日数およびその間に回帰した発情期の回数には,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかった.500 mg/kg投与群においては交尾はしたが不妊であった動物が増加し,受胎率が有意に減少した.

C. 分娩および哺育状態

分娩および哺育状態の異常は観察されなかった.

D. 出産率および妊娠期間(Table 12)

対照群の1例が妊娠25日に出産した.この1例では分娩日に全産児が死亡した.他の動物は妊娠22〜23日に出産した.出産率および妊娠期間には対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかった.

E. 妊娠黄体数,着床数および着床率(Table 12)

妊娠黄体数,着床数および着床率には,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかった.

2) 出生児

A. 生存性(Table 12)

500 mg/kg投与群の産児数,分娩率および出産生児数が対照群と比較して有意に減少し,生児出産率は減少する傾向を示した.性比には,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかった.死亡児は対照群に5例,20 mg/kg投与群に1例,500 mg/kg投与群に5例みられたが,死亡時期および死亡児の性別に一定の傾向は認められなかった.新生児の4日の生存率には,対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかった.

B. 体重(Table 12)

出生児の体重には4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められなかった.

C. 形態

全ての産児には外表奇形は認められず,哺育4日の剖検においても内部器官に異常は認められなかった.また,死亡児の剖検でも異常は観察されなかった.

考察

雌雄とも,500 mg/kg投与群においては,投与直後の一過性の流涎がみられたが,100 mg/kg以下の投与群には認められなかった.

雌雄の100 mg/kg以上の投与群においては体重の増加傾向が投与初期から継続的にみられた.また,雄では100 mg/kg以上の投与群において,雌では500 mg/kg投与群において,摂餌量がそれぞれ有意に増加した.

血液学検査では雄においては500 mg/kg投与群で,雌においては100 mg/kg以上の投与群で,それぞれ血小板数の有意な減少が認められた.血小板数の減少は,本試験の用量設定のための予備試験においても,14日間の投与で雌の1000 mg/kg投与群にみられており,4-メトキシベンズアルデヒドの投与による影響と判断されるが,本試験においては骨髄に変化は認められず,また,著しい出血等もみられないことから,その機序は明らかではない.

剖検の結果,500 mg/kg投与群の雌雄では腺胃粘膜に黒色の点あるいは領域,黒色物の付着がみられ,雌の100 mg/kg投与群においても少数例で,前胃粘膜の肥厚,水腫ならびに腺胃粘膜の黒色点がみられた.また,病理組織学検査の結果,雄の500 mg/kg投与群,雌の100 mg/kg以上の投与群では前胃に扁平上皮の過形成が認められた.4-メトキシベンズアルデヒドは局所刺激性を有することが報告されており,前胃粘膜は刺激性物質によりしばしば増殖性変化を起こすことは良く知られているところであることから4),前胃粘膜の過形成は4-メトキシベンズアルデヒドの刺激による変化と考えられる.

500 mg/kg投与群において,雄では肝臓の比体重値の有意な増加が認められ,雌では肝臓の実重量の有意な増加がみられた.また,病理組織学検査の結果,雌雄とも500 mg/kg投与群で小葉中心性の肝細胞肥大がみられ,血液生化学検査では雄の500 mg/kg投与群において,A/G比,GOT活性の増加が認められることから,4-メトキシベンズアルデヒドによる肝臓に対する影響が疑われる.

以上の結果,4-メトキシベンズアルデヒドの100 mg/kg以上の投与では,被験物質投与の影響によると考えられる体重の増加(雌雄),前胃粘膜上皮の過形成(雌),血小板数の減少(雌)が認められることから,4-メトキシベンズアルデヒドの一般毒性学的変化に関する無作用量は雌雄とも20 mg/kgと推定される.また,4-メトキシベンズアルデヒドの経口投与時の標的器官は胃ならびに肝臓であると推定される.

500 mg/kg投与群においては交尾はしたが不妊であった動物が増加し,受胎率が有意に減少した.また,産児数,分娩率および出産生児数が対照群と比較して有意に減少し,生児出産率は減少する傾向を示した.しかし,性周期の観察結果に4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められておらず,交尾は全ての動物が行い,同居から交尾までに要した日数およびその間の発情回数に対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間で有意差は認められなかった.また,500 mg/kg投与群において精巣上体重量に有意な減少が認められ,精巣上体で結節が,卵巣では卵巣嚢水腫がそれぞれ1例観察された以外,精巣,精嚢,前立腺,子宮および卵巣の病理学所見には4-メトキシベンズアルデヒド投与によると考えられる異常は認められなかった.本試験における不妊の原因としては,雄では精子形成以降の精子の運動性や成熟に対する影響,雌では受精から着床までの段階で何らかの影響が及んだ可能性が考えられるが,本試験のみからは確定することはできなかった.ベンズアルデヒドや4-メトキシベンズアルデヒド等の芳香族アルデヒドは,分離肝ミクロソームを用いたin vitroの検討によって,クエン酸回路の反応を阻害することが明らかになっている5).心筋や精子尾部等の大量のATPを消費する部位の近傍にはミトコンドリアが豊富なことが知られており6),精子の運動エネルギーは解糖系とともにミトコンドリアの呼吸から得られるとされている7).4-メトキシベンズアルデヒドにより電子伝達系に対する影響が生じた場合には,これが精子の運動性に影響を与える可能性が示唆されるものの確証は得られていない.一方,近年,4-メトキシベンズアルデヒドはチロシンを酸化脱水してL-DOPAを合成し,さらにはドーパキノンを経てメラニンの合成を行うチロシナーゼ(カテコールオキシダーゼの一種)活性を阻害することが報告されている8).ブチロフェノン誘導体やスルピリド等のドーパミン受容体拮抗作用を有する薬物は,視床下部−脳下垂体の機能抑制を介して下垂体からのゴナドトロピン分泌を抑制し,二次的に生殖器の組織・器官に変化を起こすことが知られている.しかし,ドーパミン作動性神経細胞におけるチロシンからのL-DOPA合成は,主にチロシン水酸化酵素(チロシン-3-モノオキシゲナーゼ)によって行われており,4-メトキシベンズアルデヒドによるチロシナーゼ活性阻害作用が,直ちに脳内あるいは末梢神経でのドーパミンやそれを基に合成されるノルアドレナリン等のカテコールアミン量に変化を与える事には直結しない.本試験においては雌雄とも生殖器における病理組織学所見に明確な変化はみられないことから,高用量群にみられた不妊の原因が中枢でのドーパミン量の減少によるゴナドトロピンの分泌抑制に基づくものとは考え難い.

その他,分娩および哺育状態の異常は観察されず,出産率,妊娠期間,妊娠黄体数,着床数および着床率には対照群と4-メトキシベンズアルデヒド各投与群との間に有意差は認められなかったことから,4-メトキシベンズアルデヒドの親動物の生殖能に対する無作用量は雌雄とも100 mg/kgと考えられる.

出生児の体重,形態,性比および新生児の4日の生存率には4-メトキシベンズアルデヒド投与の影響は認められなかったが,500 mg/kg投与群においては,産児数,分娩率,出産生児数および哺育4日の生児数に減少が認められることから,4-メトキシベンズアルデヒドの出生児における無作用量は100 mg/kgと考えられる.

以上の試験成績から本試験条件下では,4-メトキシベンズアルデヒドの一般毒性に関する無作用量は雌雄ともに20 mg/kg/day,生殖発生毒性に関する無作用量は雌雄とも100 mg/kg/day,出生児に対する無作用量も100 mg/kg/dayであると判断される.また,雌雄いずれに対する作用が主原因であるか不明であるが,4-メトキシベンズアルデヒドには生殖毒性が認められた.経口投与時の主たる標的器官は胃ならびに肝臓であると推定される.

文献

1)“The Merck index,” 12th. edition., eds. by S. Budavari et al, Merck & Co. Inc., Rahway, 1996, p.699.
2)“Chemical marketing reporter,” July 24, 1989, p.35.
3)“Chemical marketing reporter,” January 11, 1988, p.20.
4)J. R. Glaister,“毒性病理学の基礎,”ソフトサイエンス社,東京,1992, p.87.
5)C. R. Wolf, H. Harmon and C. M. Schiller, Biochem. Pharmacol., 31, 2025(1982).
6)B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts and J. D. Watson, “Molecular biology of the cell,” 3rd. edition., Garland Publishing Inc., New York, 1994, p.655.
7)W. C. L. Ford and J. M. Rees, “Controls of sperm motility:biological and clinical aspects,” CRC press, Boca Raton, 1990, p.195.
8)I. Kubo and I. Kinst-Hori, J. Agric. Food Chem., 46, 1268(1998).

連絡先
試験責任者:高島宏昌
試験担当者:桑形麻樹子,宮原 敬,加藤博康,関 剛幸,古谷真美,丸茂秀樹,堀内伸二,稲田浩子,三枝克彦,安生孝子,一原佐知子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
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Authers:Hiromasa Takashima(Study director)
Makiko Kuwagata, Takashi Miyahara, Hiroyasu Katou, Takayuki Seki, Mami Furuya, Hideki Marumo, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjou, Sachiko Ichihara
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