窒化ケイ素のラットを用いる経口投与簡易生殖毒性試験

Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test of Silicone nitride
by Oral Administration in Rats

要約

OECD既存化学物質安全性点検に係わる毒性調査の一環として，窒化ケイ素の0(媒体対照)，100，300および1000 mg/kg/dayをCrj:CD(SD系)IGSラットの雌雄(各12匹/群)に交配前14日間，雄ではその後交配期間を含む35日間，雌では交配期間，妊娠期間および哺育3日まで通して経口投与し，親動物に対する反復投与毒性および生殖能力ならびに次世代児の発生・発育に及ぼす影響について検討した．

1.　反復投与毒性

各群の雌雄とも死亡の発生はなく，一般状態，体重および摂餌量にも被験物質投与の影響は認められなかった．剖検，器官重量および病理組織学検査においても，被験物質投与の影響は認められなかった．

2.　生殖発生毒性

親動物の生殖機能に関しては，性周期，黄体数，着床痕数，交尾率，受胎率および交尾所要日数に被験物質投与の影響は認められなかった．分娩および哺育期検査では，妊娠期間，出産率，出産児数，出生率，新生児数，死産率，性比，新生児の哺育0および4日の体重ならびに哺育4日の生存率に被験物質投与の影響はみられず，新生児の外表検査においても，異常は認められなかった．

以上のように，反復投与毒性では被験物質投与による影響はいずれの群においても認められなかった．また，生殖発生毒性においても親動物の生殖能力および次世代児の発生・発育に及ぼす影響はいずれの群においても認められなかった．したがって，本試験条件下における反復投与毒性および生殖発生毒性に関する無影響量は，親動物および児動物ともに1000 mg/kg/dayと推察された．

方法

1.　被験物質および投与液の調製

電気化学工業(株)(東京)より提供された窒化ケイ素(Lot No. 00205，純度:97 wt%)を試験に使用した．本被験物質は灰白色系粉末である．試験期間中の被験物質の安定性については，本試験の投与期間終了後に上記の提供先にて分析を行った結果，投与期間中安定であったことが確認された．媒体にはカルボキシメチルセルロース・ナトリウム(CMC-Na)(Lot No. M1H1784，ナカライテスク(株))の0.5 %水溶液を使用した．なお，被験物質および媒体原末は室温で被験物質室の保管庫に保存し，被験物質については密閉可能な容器に乾燥剤を入れ保存した．

投与液の調製は被験物質の必要量を秤り取り，0.5 % CMC-Na溶液に懸濁して20 w/v%懸濁液を調製した．2および6 w/v%懸濁液は0.5 %CMC-Na溶液で段階希釈して調製した．用時調製とした．本被験物質の安定性については2〜20 %の範囲において室温，遮光の条件下で6時間安定であることが確認されている(日本バイオリサーチ(株))．また，初回に調製した各濃度の投与液について均一性および濃度測定を行い，設定濃度の許容範囲(± 10 %以内)にあることを確認した．

2.　使用動物および飼育条件

8週齢のCrj:CD(SD)IGSラット(日本チャールス・リバー(株))を雌雄各55匹購入し，13日間の検疫・馴化を 行った．この期間中に一般状態の観察，体重測定および性周期観察を行い，異常がないことを確認したのち，雌雄各48匹を選抜し，10週齢で試験に使用した．動物は温度24 ± 2 ℃，湿度55 ± 10 %，照明12時間(午前7時〜午後7時)および換気回数13〜15回/時に設定したバリアーシステム区域で飼育した．検疫・馴化期間中は2〜3匹，群分け後は個別(ただし，交配期間中は雌雄各1匹)にステンレススチール製ケージに収容した．また，交尾が確認された雌動物については，床敷を入れたポリカーボネイト製ケージに個別に収容した．飼料は高圧蒸気滅菌処理した固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))を，飲水は次亜塩素酸ナトリウムを添加(約2 ppm)した井戸水を給水瓶または自動給水装置によりそれぞれ自由に摂取させた．

3.　投与量，投与方法，試験群構成および群分け

投与量は，(株)日本バイオリサーチセンターで実施された雄ラットを用いた2週間反復経口投与による予備試験(投与量:0，125，250，500および1000 mg/kg)の結果から設定した．すなわち，当該試験では1000 mg/kgを投与しても一般状態，体重，摂餌量および剖検所見に異常は認められなかった．したがって，本試験では，1000 mg/kgを高用量とし，以下公比約3で除して300および100 mg/kgをそれぞれ中用量および低用量に設定した．また，媒体のみを投与する対照群を設けた．1群当たりの動物数は雌雄各12匹とし，群分けは，投与開始前日に，その日の体重を基に層別連続無作為化法で行った．

投与経路は経口とし，雄は交配前14日間およびその後35日間の合計49日間，雌は交配前14日間，交配期間(交尾成立までの最長14日間)，妊娠期間および哺育3日までの期間，それぞれ1日1回投与した．なお，投与開始日を投与1日とした．投与容量は5 mL/kgとし，対照群には同容量の0.5 % CMC-Na溶液を投与した．雄ならびに交配前および交配期間中の雌の投与液量は最新体重を基に，交尾成立後の雌の投与液量は妊娠0日の体重を基にそれぞれ算出した．

4.　反復投与毒性に関する観察・検査

1)　一般状態

雌雄とも，全例について一般状態の観察および生死の確認を毎日投与前および投与後の2回行った．

2)　体重および摂餌量

体重については，雄では投与期間を通して週2回測定した．雌では，交配前の投与期間および交配期間中は週2回，妊娠期間中は妊娠0，7，14および21日，哺育期間中は哺育0(分娩日)および4日に測定した．

摂餌量については，雄では交配期間を除く投与期間中に週2回測定した．雌では，交配前の投与期間中は週2回，妊娠期間中は妊娠1，7，14および21日，哺育期間中は哺育1および4日に測定した．

3)　病理学検査

雌雄ともエーテル麻酔下で外側腸骨動脈切断により放血致死させた後，解剖して諸器官および組織の肉眼的観察を行った．更に，雌については，黄体数および着床痕数を調べ，着床率[(着床数/黄体数)× 100]を算出した．剖検後，雄は精巣および精巣上体，雌は卵巣について重量を測定するとともに，剖検日の体重を基に体重比器官重量(相対重量)を算出した．重量測定器官に加え，肉眼的異常器官・組織を10 %中性緩衝ホルマリン溶液(ただし，精巣および精巣上体はブアン液で前固定)で固定して保存した．対照群および高用量群の精巣，精巣上体，卵巣および肉眼的異常部位についてはパラフィン切片としたのち，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した．

5.　生殖発生毒性に関する観察・検査

1)　生殖機能

雌について，投与開始日(投与1日)から15日間，毎日午前の一定時間に膣垢を採取し，性周期検査を行った．性周期検査では，発情期から次の発情期までの間の日数を発情周期日数とし，平均発情周期を算出した．

交配は投与15日の午後4時頃から，雌雄ラット(12週齢)を1対1で一晩同居させる方法で行い，翌朝膣垢中の精子または膣栓の存在により交尾を確認し，その日を妊娠0日とした．また，交配は同一群内で行い，交配期間は最長2週間とした．交配期間終了後，交尾所要日数，交尾率[(交尾動物数/同居動物数)× 100]および受胎率[(受胎動物数/交尾動物数)× 100]を算出した．

2)　分娩および哺育状態ならびに新生児の観察

交尾が確認された雌については全例を自然分娩させ，分娩徴候を含めた分娩状態ならびに授乳および営巣などの哺育状態を観察するとともに，妊娠期間および出産率[(生児出産雌数/妊娠雌数)× 100]を算出した．なお，分娩の確認は午前中に限定し，午後12時を過ぎて分娩した個体は，翌日に分娩したものとみなした．出産児については，分娩時に出産児数，新生児数，死産児数，新生児の性別および外表異常を検査した．新生児については，出生日および哺育4日に体重を個体ごとに測定するとともに出生率[(新生児数/着床痕数)× 100]，死産率[(死産児数/出産児数)× 100]および新生児の4日の生存率[(哺育4日の生児数/出生児数)× 100]を算出した．哺育4日に新生児の全例をエーテル麻酔下で放血致死させ，器官・組織の肉眼的観察を行った．また，出産児(死産児および死亡児を含む)については，剖検後一腹単位で純エタノールに固定保存した．

6.　統計解析

体重，摂餌量，交尾所要日数，性周期検査値(発情周期)，器官重量，体重比器官重量，妊娠期間，黄体数，着床痕数，総出産児数，新生児数および新生児体重については，各群ごとに平均値と標準偏差を求め，対照群と被験物質投与群間で分散の均一性をBartlett法により検定した．分散が均一な場合は，Dunnettの多重比較検定を用いて対照群との比較を行い，分散が均一でない場合は，Steelの多重比較検定を用いて対照群との比較を行った．いずれの場合も有意水準を1および5 %とし，両側検定とした．また，交尾率，受胎率，出産率および新生児の性比についてはχ2検定により，着床率，死産率，出生率および新生児の4日の生存率についてはWilcoxonの順位和検定により，病理組織学検査については Mann-WhitneyのU検定により対照群と各投与群間の比較を行った．いずれの場合も有意水準を5 %とした．なお，新生児に関する測定値については一腹単位で処理した．

結果

1.　反復投与毒性

1)　一般状態

各群の雌雄とも死亡の発生はなかった．1000 mg/kg群の雌1例で妊娠18日から剖検日まで胸部皮下に腫瘤が認められた．このほか，偶発的変化と思われる胸部の脱毛が300 mg/kg群の雄1例で投与15日から剖検日まで認められた．

2)　体重(Fig. 1)

雌雄とも，被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．

3)　摂餌量

雄では，被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．

雌では，1000 mg/kg群で投与2日に対照群と比較して有意な低値がみられたが，一過性の変化であり，体重に変動はみられていないことから，被験物質投与と関連のない偶発的変化と考えられた．

4)　器官重量(Table 1)

雌雄とも，被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．

5)　剖検所見

1000 mg/kg群の雌1例で胸部皮下の灰白色腫瘤が認められた．このほか，偶発的変化と思われる精巣上体の黄白色結節が100および1000 mg/kg群の雄各1例，胸部皮膚の脱毛が300 mg/kg群の雄1例で認められた．

6)　病理組織学検査(Table 2, 3)

1000 mg/kg群の雌1例で乳腺腺癌が認められた．このほか，偶発的変化と思われる精巣上体の精子肉芽腫が100および1000 mg/kg群の雄各1例に認められた．なお，肉眼的に脱毛がみられた300 mg/kg群の雄1例では，当該部に変化は認められなかった．

2.　生殖発生毒性

1)　生殖機能(Table 4)

性周期検査では，被験物質投与群と対照群との間で発情周期に有意な差は認められなかった．

生殖能力検査では，1000 mg/kg群の1組を除いてすべてに交尾がみられ，全例が妊娠した．したがって，交尾率は対照群，100，300および1000 mg/kg群でそれぞれ100，100，100および91.67 %，受胎率はいずれの群においても100 %であり，被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．また，交尾所要日数においても，被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．なお，1000 mg/kg群の未交尾例では，雌雄とも生殖器の剖検および病理組織学検査において変化はみられず，受胎能の欠如を示唆する所見は認められなかった．

2)　分娩および哺育ならびに新生児の観察(Table 5)

分娩時の検査では，100 mg/kg群で対照群と比較して妊娠期間の有意な短縮がみられたのみで，黄体数，着床痕数，着床率，出産児数，出生率，新生児数，雌雄新生児体重，死産率，出産率および新生児の性比には被験物質投与群と対照群との間で有意な差は認められなかった．新生児の外表検査においても，各群とも異常は認められなかった．

哺育期の検査では，新生児の4日の生存率および体重で被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．

考察

1.　反復投与毒性試験

各群の雌雄とも死亡の発生は認められなかった．また，一般状態，体重，摂餌量，剖検，器官重量および病理組織学検査においても，被験物質投与の影響は認められなかった．なお，1000 mg/kg群の雌1例で乳腺腺癌が認められたが，1例のみの発現であり，同系，同週齢ラットの雌で自然発生することが報告されていることから1)，被験物質投与とは関連のない偶発的変化と考えられた．

以上のように，いずれの被験物質投与群においても被験物質の反復投与による影響は認められなかったことから，本試験条件下における反復投与毒性に関する無影響量は，雌雄とも1000 mg/kg/dayと推察された．

2.　生殖発生毒性

親動物の生殖機能に関しては，発情周期，交尾所要日数，黄体数，交尾率，着床痕数および受胎率に被験物質投与の影響は認められなかった．

分娩時の観察では，妊娠期間，出産率，出産児数，出生率，新生児数，雌雄出生児体重，死産率および新生児の性比に被験物質投与の影響はみられず，外表異常も認められなかった．哺育期の観察では，新生児の4日の生存率および体重に被験物質投与の影響は認められなかった．

以上のように，親動物の生殖能力および次世代児の発生・発育に及ぼす被験物質投与の影響はいずれの群においても認められなかったことから，本試験条件下における生殖発生毒性に関する無影響量は，親動物および児動物ともに1000 mg/kg/dayと推察された．

文献

1)釜田悟ら，化学物質毒性試験報告，2, 157(1995).

連絡先
試験責任者：木村栄介
試験担当者：島津伸也，浜村政夫，大西幹男，和泉宏幸，鍬先恵美子
(株)パナファーム・ラボラトリーズ安全性研究所
〒869-0425　熊本県宇土市栗崎町1285
Tel 0964-23-5111Fax 0964-23-2282

Correspondence
Authors:Eisuke Kimura(Study director)
Shinya Shimazu, Masao Hamamura, Mikio Oonishi, Hiroyuki Izumi, Emiko Kuwasaki
Safety Assessment Laboratory, Panapharm Laboratories Co., Ltd.
1285 Kurisaki-machi, Uto-shi, Kumamoto, 869-0425, Japan
Tel +81-964-23-5111Fax +81-964-23-2282