2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)の
細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-p-cresol)on Bacteria

要約

既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として, 2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール) について,細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し,陰性の結果を得た.

検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により用量設定試験および本試験を行った.用量設定試験を50〜5000 μg/プレートの用量で行ったところ,すべての検定菌においてS9 mix無添加試験および添加試験のいずれも抗菌性は認められなかった.したがって,本試験ではS9 mix無添加試験および添加試験を313〜5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して実施した.

その結果,復帰変異コロニー数は, 2回の本試験とも,用いたすべての検定菌においていずれの用量においても,増加は認められなかったことから,2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)は,用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.

方法

〔検 定 菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537
S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた.

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.

検定菌は− 80℃以下で凍結保存したものを用い,各ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

〔被験物質〕

2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)(CAS No. 119-47-1)は,分子量340.51の白色結晶性粉末である.試験には,住友化学工業(株)製〔ロット番号:40401,純度 98%以上(不純物:不明)〕のものを,(社)日本化学工業協会から供与され,使用時まで室温保管し,用いた.

2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)は,アセトンに溶解性がよいことから,アセトンに50 mg/mlになるように溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.

試験の開始に先立って, 2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)のアセトン溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,低濃度(50.0 mg/ml)溶液は,染色体異常試験で調製したものについて,高濃度(50.0 mg/ml)溶液は本試験気把汗修靴燭發里砲弔い董ぜ鴫梗弩条件下で,安定性を調べた.その結果,調製4時間後における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して,99.9および98.4%であった.また,含量測定試験を行った結果,調製液の濃度は,低濃度(3.1 mg/ml)は90.3%,高濃度(50.0 mg/ml)溶液は100%であった.

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.
AF-22-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SAアジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9-AA9-アミノアクリジン(Sigma Chem.Co.)
2-AA2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2, 2AAはジメチルスルホキシド(DMSO,和光純薬工業(株))に溶解したものを-20℃で凍結保存し,用時解凍した.9AAはDMSOに,SAは純水に溶解し,速やかに試験に用いた.

〔培地および S9 mix の組成〕

1) トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー(Difco)0.6%
塩化ナトリウム0.5%
(B)*L-ヒスチジン0.5mM
ビオチン0.5mM
*:WP2 uvrA 用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物0.2g
クエン酸・1水和物2g
リン酸水素二カリウム10g
リン酸一アンモニウム1.92g
水酸化ナトリウム0.66g
グルコース20g
バクトアガー(Difco)15g
径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

1ml中下記の成分を含む
S9**0.1ml
塩化マグネシウム8μmol
塩化カリウム33μmol
グルコース-6-リン酸5μmol
NADH4μmol
NADPH4μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH7.4)100μmol

**:7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた.

〔試験方法〕

プレート法により, S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った.

小試験管中に,被験物質調製液 0.1 ml,リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 ml),検定菌液0.1 mlおよびトップアガー2 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.

用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において,被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が,溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し,かつ,その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした.

結果および考察

〔用量設定試験〕

2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)について50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として,試験を実施したところ,すべての検定菌においてS9 mix 無添加試験および添加試験のいずれも抗菌性は認められなかった.

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1, 2に示した.2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)の用量を,S9 mix無添加試験および添加試験でともに313〜5000 μg/プレートの範囲で公比を2として試験を実施した.その結果,2回の試験のいずれも,用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において,溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果に基づき, 2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)は,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:原  巧,坂本京子,川上久美子,
清水ゆり,松木容彦,中込まどか,
中尾美津男,飯田さやか
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami,
Yuri Shimizu, Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi,
Mitsuo Nakao, Sayaka Iida
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627