1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタンのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 1,2-Bis(stearoylamino)ethane in Rats

要約

1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタンを0(対照群)，100，300および1000 mg/kgの用量でCD(SD)IGS[SPF]系雌雄ラットに28日間強制経口投与し，その毒性を検討した．対照群および1000 mg/kg群については，別に14日間の回復群を設けた．

雌雄いずれの投与群にも被験物質に起因すると考えられる異常動物は認められず死亡例もみられなかった．体重および摂餌量測定の結果，雌雄いずれの投与群とも被験物質に起因すると考えられる変化は認められなかった

血液学検査，血液凝固能検査，血液生化学検査，尿検査およびの器官重量測定の結果，雌雄いずれの投与群とも被験物質に起因すると考えられる変化は認められなかった．

病理学検査の結果，肉眼所見および組織学所見ともに被験物質の影響を示唆する所見は認められなかった．

以上の結果から，本試験条件下における1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタンの無影響量は，雌雄とも被験物質に起因する変化が認められなかった1000 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質

1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタン[日本油脂(株)(東京)提供，Lot No. 90101Y，純度99.7 wt%]は熱に安定な白色粉末状の化合物である．

2.　供試動物

供試したSprague-Dawley系ラット[Crj:CD(SD)IGS，SPF]は日本チャールス・リバー(株)から4週齢で購入した．動物を検収後，試験環境に9日間馴化後，体重増加が順調で一般状態に異常を認めなかった雌雄各30匹を選び，5週齢で投与を開始した．動物は群分け当日の体重に基づいて層別化し，平均体重が均等となるように各群に割り付けた．投与開始時の体重は雄が122〜134 g，雌が102〜113 gであった．

3.　飼育条件

動物は温度23 ± 3 ℃，相対湿度55 ± 20 %，換気回数20回/時，照明150〜300 lux，照明時間12時間(午前7時点灯，午後7時消灯)に設定されたバリアシステム飼育室で飼育した．アルミ製前面・床ステンレス網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容した．オリエンタル酵母工業(株)製造の放射線滅菌改良NIH公開ラット，マウス飼料および水道水を自由に摂取させた．飼育ケージは隔週1回，給餌器は週1回取り換えた．

4.　試験群の構成

試験群は0，100，300および1000 mg/kgの4群とし，1群雌雄各5匹を用い，0および1000 mg/kg群に雌雄各5匹の回復群を設け，計60匹を使用した．

[用量設定理由]

用量設定のための2週間反復投与試験を0，100，300および1000 mg/kgの4用量で実施した結果，雌雄とも全ての投与群で被験物質に起因すると考えられる変化は認められなかった．従って，28日間反復投与毒性試験の最高用量を1000 mg/kgとし，以下公比約3で除し，中用量を300 mg/kg，低用量を100 mg/kgと設定した．

5.　投与方法

被験物質はコーン油に溶解し，胃ゾンデを用いて胃内に強制経口投与した．投与容量は体重100 g当たり0.5 mLとした．対照群には媒体のみ投与した．なお，投与期間は28日間とし，0および1000 mg/kg群についてはさらに投与期間終了後に2週間の回復期間を設けた．

6.　投与液の調製

被験物質を濃度が2.0，6.0および20.0 w/v%となるようにコーン油に溶解し，必要量を調製した．1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタンは特性上，分析機器を用いての測定が不可能であったため安定性が確認できなかった．従って，投与液の調製は毎日1回，投与直前に実施した．

7.　検査項目

1)　一般状態の観察

全動物を投与期間中は毎日3回(投与前，投与後1および5時間)観察し，中毒症状の有無や行動異常を記録した．

2)　体重

投与開始から回復期間終了まで毎週1回測定した．

3)　摂餌量測定

毎週1回給餌した残量を測定し，飼料摂取量(g/week)を算出した．

4)　血液学検査

投与期間終了時および回復期間終了時の計2回実施した．採血するに当たり，動物は約16時間絶食させた．動物をエーテルで麻酔後開腹し，腹部大動脈から採血した．採取した血液の一部にEDTA-2Kを添加し，ヘマトクリット値(HCT:RBC, MCVより算出)，ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法)，赤血球数(RBC:暗視野板法)，平均赤血球容積(MCV:暗視野板法)，平均赤血球血色素量(MCH:HGB, RBCより算出)，平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB, HCTより算出)，血小板数(PLT:暗視野板法)，白血球数(WBC:フローサイトメトリー法)および白血球百分率を血液自動分析装置THMS H・1E(米国マイルス社)を用いて測定した．さらに，3.13 %クエン酸ナトリウム水溶液添加血液の血漿を用いて，プロトロンビン時間(PT:Quick 1段法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT:クロット法)およびフィブリノーゲン量(Fibrinogen:トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)で測定した．

5)　血液生化学検査

血液学検査に引き続き採取した血液を静置後，遠心分離して得られた血清を用いて，総蛋白(T. protein:Biuret法)，アルブミン(Albumin:BCG法)，A/G(A/G:総蛋白およびアルブミンより算出)，血糖(Glucose:HK-G-6-PDH法)，中性脂肪(Triglyceride:GK-GPO遊離グリセロール消去法)，総コレステロール(T. cholesterol:コレステロールオキシダーゼESET法)，尿素窒素(BUN:ウレアーゼGLDH法)，クレアチニン(Creatinine:酵素法)，総ビリルビン(T. bilirubin:バナジン酸酸化法)，アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST:酵素-UV法)，アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT:酵素-UV法)，アルカリホスファターゼ(ALP:P-ニトロフェニルリン酸基質法)，γ-グルタミルトランスペプチターゼ(γ-GTP:L-γ-グルタミル-3-カルボキ-4NA基質法)，カルシウム(Calcium:MXB法)および無機リン(I. phosphorus:PNP-XDH法)を多項目生化学自動分析装置日立7170((株)日立製作所)を用いて，ナトリウム(Sodium:イオン選択電極法)，カリウム(Potassium:イオン選択電極法)および塩素(Chloride:イオン選択電極法)を電解質測定装置EA06R((株)エイアンドティー)を用いて測定した．

6)　尿検査

投与期間終了週および回復期間終了週の計2回実施した．検査動物を代謝ケージに個別に収容し，給餌給水の条件下で3時間尿(午前10時から午後1時まで)および24時間尿(午前10時から翌日午前10時まで)を採取した．3時間尿を用いて，N-マルティスティックスSG(バイエル・三共(株)と尿分析装置CLINITEK 500(バイエル社)でpH，潜血，ケトン体，糖，蛋白，ビリルビン，ウロビリノーゲンを検査した．24時間尿を用いて，尿量，色調，尿比重および尿沈渣を検査した．なお，尿比重は，尿比重屈折計UR-S((株)アタゴ)で測定した．また，尿を1500 r.p.m.で5分間遠心し，残渣を用いてステルンハイマー変法による染色を施し，尿沈渣について鏡検した．

7)　病理学検査

投与期間終了時および回復期間終了時の全動物をエーテル麻酔し，放血致死させ病理解剖を実施した．解剖では動物の体表，体腔および諸器官について観察した．観察された肉眼的異常(部位，大きさ，硬さなどを)は全て記録した．

器官重量は脳，肝臓，腎臓，副腎，胸腺，脾臓，精巣，精巣上体および卵巣について重量を測定した．投与28日または回復14日の測定体重および器官重量から器官重量/体重比(相対重量)を算出した．また，脳(大脳，小脳，橋を含む)，脊髄，下垂体，眼球，唾液腺(顎下腺，舌下腺)，甲状腺，上皮小体，心臓，胸腺，肺(気管支を含む)，気管，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，胃，小腸(パイエル氏板を含む)，大腸，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，子宮，腟，膀胱，末梢神経(坐骨神経)，リンパ節(下顎リンパ節，腸間膜リンパ節)，骨髄(大腿骨)，大動脈および皮膚を十分な量の10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した．但し，精巣および精巣上体はブアン液で前固定した後，10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した．

病理組織学検査は固定した器官・組織のうち，投与期間終了時に解剖した対照群および高用量群の胸腺，心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体，子宮，卵巣，骨髄(大腿骨)について実施した．また，肝臓および腎臓については低用量および中用量群も組織学検査を実施した．皮下部の腫瘤についても組織学検査を行った．なお，回復期間終了時の病理組織学検査は，投与期間終了時の解剖動物において対照群と被験物質投与群間に有意に増減を示した所見が認められなかったことから，実施しなかった．組織標本は，常法に従ってパラフィン包埋，薄切後，ヘマトキシリン・エオジン染色を施した．鏡検では，病変の種類および程度を含む各所見について記録した．

8.　統計解析

各試験群の体重，摂餌量，血液学検査値，血液凝固能検査値，血液生化学検査値，尿検査値(尿量および尿比重のみ)，器官重量および器官重量/体重比は，最初にBartlettの等分散検定を実施した．等分散の場合はDunnettの多重比較検定1, 2)で対照群と各投与群間の有意差を検定した．Bartlettの等分散検定で不等分散の場合はSteelの検定3)で対照群と各投与群間の有意差を検定した．上記定量値の有意水準は5および1 %の両側検定で実施した．また，病理学検査結果の検定はFisherの確率計算法を用いた．

結果

1.　一般状態

投与期間中，雌の1000 mg/kg群の1例において外傷および皮下部の腫瘤が耳介基部に観察された．回復期間では雌雄いずれの群にも異常動物は認められなかった．なお，投与期間および回復期間を通して，雌雄いずれの群にも死亡例は認められなかった．

2.　体重(Fig. 1)

雌雄とも投与期間および回復期間を通して，対照群と被験物質投与群で平均体重に差は認められなかった．

3.　摂餌量

雌では，対照群に比較して300および1000 mg/kg群で投与4週に摂餌量が高値を示したが，継続性のない変化であった．回復期間においては雌雄とも対照群に比較して1000 mg/kg群で差がみられなかった．

4.　血液学検査(Table 1)

[投与期間終了時の検査結果]

雄では，対照群に比較して300および1000 mg/kg群でMCHが高値を示した．また，1000 mg/kg群ではMCVが高値を示した．いずれも生理的変動の範囲(対照群の平均値± 2SD)内での変化であった．その他，300 mg/kg群で赤血球数が僅かに低値を示したが，用量に関連しない変化であった．

雌では，対照群に比較して100 mg/kg群で好酸球比率が僅かに低値を示したが，用量に関連しない変化であった．

[回復期間終了時の検査結果]

雌では，対照群と比較して1000 mg/kg群でMCHが僅かな高値を示したが，投与終了時の結果においてはみられなかった変化であった．

5.　血液凝固能検査(Table 1)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群と比較して各投与群で差がみられなかった．

[回復期間終了時の検査結果]

雌雄とも対照群と1000 mg/kg群で差が認められなかった．

6.　血液生化学検査(Table 2)

[投与期間終了時の検査結果]

雄では，対照群に比較して100 mg/kg群でγ-GTPが僅かに高値を示した．

雌では，対照群に比較して100 mg/kg群で中性脂肪が高値および塩素が僅かに低値を示した．また，300 mg/kg群ではアルカリホスファターゼが低値を示した．しかし，雌雄いずれの変化も用量に関連しない変化であった．

[回復期間終了時の検査結果]

雄では，対照群に比較して1000 mg/kg群でγ-GTPが僅かに高値を示したが，軽微で毒性学的に意義のある変化ではなかった．

7.　尿検査(Table 3)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群に比較して各投与群で差が認められなかった．

[回復期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群に比較して1000 mg/kg群で差が認められなかった．

8.　器官重量(Table 4)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群に比較して各投与群の全ての器官において差が認められなかった．

[回復期間終了時の検査結果]

雄では，対照群に比較して1000 mg/kg群で胸腺実重量が低値を示したが，投与終了時の結果ではみられなかった変化であった．

9.　器官重量/体重比(Table 4)

[投与期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群に比較して各投与群の全ての器官において差が認められなかった．

[回復期間終了時の検査結果]

雌雄とも，対照群に比較して1000 mg/kg群の全ての器官において差が認められなかった．

10.　病理学検査

1)　剖検所見(Table 5)

[投与期間終了時の検査結果]

剖検所見では，脾臓の白色斑/区域が雄の対照群で，胸腺の黒色斑/区域が雌の対照群で，小腸の憩室が雄の対照群で，肝臓の肥大が雄の300 mg/kg群で，腎臓の嚢胞が雌雄の100 mg/kg群で，腎臓の腎盂拡張が雄の対照群で，瘢痕が雌の100 mg/kg群で，卵巣の嚢胞が対照群で，子宮の内腔拡張が300 mg/kg群で，皮下部の腫瘤が雌の1000 mg/kg群で，それぞれ単発的に観察された．

[回復期間終了時の検査結果]

剖検所見では，腎臓の瘢痕が雄の対照群に単発的に観察された．

2)　組織所見(Table 6)

[投与期間終了時の検査結果]

心臓のリンパ球浸潤が雄の1000 mg/kg群に1例，線維化が雄の対照群に1例，胸腺のケルスタイナー氏嚢胞が雌の対照群および1000 mg/kg群にそれぞれ1例認められた．肝臓では周辺性脂肪化が雄の300 mg/kg群で1例，雌の対照群，100および1000 mg/kg群にそれぞれ1例，鉱質沈着が雄の1000 mg/kg群に1例，壊死が雌の300 mg/kg群で1例，細胞浸潤が雄の対照群および1000 mg/kg群に1および3例，リンパ球浸潤が雄の対照群および1000 mg/kg群にそれぞれ1例，雌の対照群および1000 mg/kg群に2および1例，小肉芽腫が雄の対照群，100，300および1000 mg/kg群に5，3，4および3例，雌の対照群，100，300および1000 mg/kg群に5，4，2および5例，髄外造血が雄の対照群に1例それぞれ認められた．腎臓では尿細管好塩基化が雄の対照群100，300および1000 mg/kg群に3，3，4および5例，雌の対照群および1000 mg/kg群に1および3例，嚢胞が雌の100 mg/kg群に1例，管腔拡張が雄の100および1000 mg/kg群でそれぞれ1例，雌の100，300および1000 mg/kg群で1，2および1例，硝子滴変性が雄の対照群および1000 mg/kg群に1および2例，雌の1000 mg/kg群に1例，鉱質沈着が雄の1000 mg/kg群に1例，雌の対照群に2例，リンパ球浸潤が雄の300および1000 mg/kg群で1および2例，雌の対照群，300および1000 mg/kg群にそれぞれ1例が認められた．精巣の変性と精巣上体の小肉芽腫が1000 mg/kg群でそれぞれ1例，子宮の内腔拡張が雌の対照群で1例に認められた．

考察

投与期間および回復期間を通じて，雌雄いずれの群にも死亡例は認められなかった．

一般状態の観察では，雌の1000 mg/kg群の1例に外傷と皮下部の腫瘤が認められた．外傷は自傷であり，同部位に観察された皮下部の腫瘤は外傷に起因する膿瘍であり，被験物質に起因する変化とは考えられなかった．

体重および摂餌量おいては，雌雄とも対照群と被験物質投与群とに差が認められなかった．

血液学検査および血液凝固能検査の結果，雌雄とも被験物質の影響は認められなかった．

血液生化学検査の結果，雌雄とも被験物質の影響は認められなかった．

尿検査の結果，雌雄とも被験物質の影響は認められなかった．

器官重量測定の結果，雌雄の各投与群とも対照群と比較して測定した全ての器官において差が認められず，被験物質の影響はみられなかった．

病理学検査の結果，剖検所見には被験物質の影響と考えられる変化は認められなかった．組織学検査において腎臓で観察された所見は対照群と比較して有意差がなかったことから自然発生性のものと考えられた．また，肝臓の細胞浸潤は低用量および中用量群では観察されず，高用量群での発生も対照群と比較して有意差が認められないことから自然発生性の変化と考えられた．

以上の結果から，本試験における1,2-ビス(ステアロイルアミノ)エタンの無影響量は雌雄とも被験物質に起因する変化が認められなかった1000 mg/kg/dayと判断された．

文献

1)佐野正樹，岡山佳弘，医薬安全性研究会会報，32, 21(1990).
2)M. Yoshida, J. Japanese Soc. Comp. Stat. 1, 111(1988).
3)倍味繁，稲葉太一，医薬安全性研究会会報，40, 33(1994).

連絡先
試験責任者：渡　修明
試験担当者：各務　進，伊賀達也，向井大輔， 宮島留美子，大橋信之
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Nobuaki Watari(Study director)
Susumu Kakamu, Tatsuya Iga, Daisuke Mukai, Rumiko Miyajima, Nobuyuki Oohashi
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Arahama, Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393