チオフェンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Thiophene on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として,チオフェンについて,細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し,陰性の結果を得た.

検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により,用量設定試験を50〜5000 μg/プレートの用量で行ったところ,S9 mix無添加試験,添加試験のいずれもWP2 uvrA 以外の検定菌において,高用量群で抗菌性が認められた.したがって,本試験では S9 mix無添加試験および添加試験のいずれもTA1537では78.1 〜2500 μg/プレート,WP2 uvrAでは313〜5000 μg/プレート,その他は156〜5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して試験を実施した.

その結果, S9 mix無添加試験および添加試験のいずれも 2500 〜5000 μg/プレートの用量で抗菌性が認められた.復帰変異コロニー数は,2回の本試験とも,用いた検定菌について,いずれの用量においても増加は認められなかったことから,チオフェンは用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた.

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.

検定菌は− 80℃以下で凍結保存したものを用い,ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

〔被験物質〕

チオフェン (CAS No. 110-02-1)は,分子量 84.14の無色透明の液体である.試験には,東京化成工業(株)製,〔ロット番号:FGB01,純度98%(不純物:不明)〕のものを購入し,使用時まで冷蔵保管した.

チオフェンは,ジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解性がよいことから,DMSOに50 mg/mlまたは25 mg/mlの割合で溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.

試験の開始に先立って,チオフェンの DMSO 溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,低濃度(0.781 mg/ml)溶液は本試験兇把汗修靴燭發里砲弔い董い泙森眷仕(168 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて,室温遮光条件下で,安定性を調べた.その結果,調製4時間後における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間) の平均値に対して,100および101%であった.また,含量測定試験を行った結果,調製液の濃度は,低濃度は89.7%とやや低い値であったが,高濃度は95.2%であった.

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.
AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2, 2AA は DMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを−20℃で凍結保存し,用時解凍した.9AAはDMSO に,SAは純水に溶解し,速やかに試験に用いた.

〔培地および S9 mix の組成〕

1) トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー(Difco)0.6
塩化ナトリウム0.5
(B)*L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5mM
*:WP2 uvrA用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた.なお,培地1 lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム 0.66 g
グルコース20g
バクトアガー(Difco)15g
径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある.

3) S9 mix

1 ml中下記の成分を含む
S9**0.1  ml
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコースー6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウムーリン 酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
**:7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた.

〔試験方法〕

プレート法により, S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った.

小試験管中にトップアガー 2 ml,被験物質調製液0.1 ml,リン酸緩衝液0.5 ml(S9 mix添加試験においては S9 mix 0.5 ml),検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培       地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った.

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において,被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が,溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し,かつ,その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした.

結果および考察

〔用量設定試験〕

50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として,試験を実施したところ,S9 mix 無添加試験,添加試験のいずれも TA1537では1500 μg/プレート以上で,また TA100,TA1535,A98の3菌株では5000 μg/プレートで抗菌性が認められたが,WP2 uvrAのみ最高用量においても抗菌性は認められなかった.

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1,2に示した.チオフェンの用量を,S9 mix無添加試験,添加試験のいずれもTA1537 では78.1〜2500μg/プレート,WP2 uvrAでは313〜5000 μg/プレート,その他は156〜5000 μg/プレートの範囲で公比を2として設定し試験を実施した.その結果,2回の試験のいずれも,用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において,溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果に基づき,チオフェンは,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J . Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:坂本京子,川上久美子,原  巧,
清水ゆり,堀谷尚古,松木容彦,
中込まどか,中尾美津男,
飯田さやか
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所
〒257 秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami,
Takumi Hara, Yuri Shimizu,
Naoko Horiya, Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi, Mitsuo Nakao and
Sayaka Iida
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627