2-(1-メチルエトキシ)エタノールの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 2-(1-Methylethoxy)ethanol in Bacteria

要約

2-(1-メチルエトキシ)エタノールについて,細菌を用いる復帰変異試験を実施した.

試験菌株として,Salmonella typhimurium(TA100,TA98,TA1535,TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた.用量設定試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において8.19〜5000 μg/plateの8用量,本試験では313〜5000 μg/plateの5用量で試験を実施した.

その結果,S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても,溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった.これら両試験系での試験結果は,用量設定試験および本試験において再現性が確認された.

以上の結果より,本試験条件下では2-(1-メチルエトキシ)エタノールは,変異原性を有しない(陰性)と結論した.

方法

1. 試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから,試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100,TA98,TA1535およびTA15371)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA2)の5種類の菌株を選択した.

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から,また,大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた.平成12年10月27日に菌株の特性検査を実施し,本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した.

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後,凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した.これを液体窒素を用いて凍結し,超低温フリーザーに-80 ℃で保存した.

2. 培地の調製

1) 最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業(株)製のテスメディアAN培地を購入し,試験に用いた.本プレートは,Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩,0.2 %クエン酸・1水塩,1 %リン酸二カリウム・無水塩,0.192 %リン酸一アンモニウム,0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5 %の寒天(伊那寒天BA-30A)を加え,径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである.

2) トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5 w/v%を含む0.6 w/v% Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し,ネズミチフス菌を用いる試験の場合,0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え,大腸菌を用いる試験の場合,0.5 mmol/L L-トリプト ファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた.

3. 前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 w/v%ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2: OXOID)溶液を25 mL分注し,これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した.ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い,37 ℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し,菌濃度を確認した後試験に使用した.

4. S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した.S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである.S9 mixの組成を以下に示す.
成分S9 mix 1 mL中の量
S90.1 mL
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
蒸留水残量

5. 被験物質

2-(1-メチルエトキシ)エタノール(ロット番号:30321)は純度99.5 %以上(不純物として水分0.1 %以下を含む)の透明液体である.本剤は20 ℃の水および常温でのアセトンに完全に溶解し,水溶液中で安定である.三井化学(株)(東京)から提供された被験物質を使用した.被験物質は,使用時まで室温で保管した.試験終了後,被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果,安定性に問題はなかった.

6. 被験物質液の調製

試験の都度,被験物質を日本薬局方注射用水((株)大塚製薬工場)を用いて溶解して調製原液とした.調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後,速やかに処理を行った.

7. 試験用量の設定

8.19〜5000 μg/plateの8用量(公比2.5)を用いて用量設定試験を実施した.S9 mix無添加群および添加群の各試験菌株でいずれの用量においても復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった.また,各試験菌株のいずれの処理群においても,生育阻害作用は観察されなかった.なお,コロニー計数時,析出等の特筆すべき変化は観察されなかった.

従って,本試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において5000 μg/plateを最高用量とし,それぞれ5用量(公比2)を設定した.

8. 陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した.これらの陽性対照物質はDMSOを用いて溶解し,少量ずつ分注した後凍結保存(-20 ℃)した.
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich社)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株))

9. 試験方法

Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて,S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した.試験管に,使用溶媒,被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL,次いでS9 mix無添加群の場合,0.1 mol/Lナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL,S9 mix添加群の場合,S9 mixを500 μL添加し,さらに試験菌液100 μLを加え,37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した.培養終了後,あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し,混合液をプレート上に重層した.37 ℃の条件で48時間各プレートを培養した後,被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため,実体顕微鏡(× 60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した.次いで,復帰突然変異により生じたコロニーを計数した.計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた.各濃度につき3枚のプレートを使用した.

10. 結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し,かつ,再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に,陽性と判定した.

なお,統計学的手法を用いた検定は実施しなかった.

結果および考察

用量設定試験の結果をTable 1〜2に,本試験の結果をTable 3〜4に示した.S9 mix無添加群ならびに添加群ともいずれの試験菌株においても,2-(1-メチルエトキシ)エタノール処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった.また,各試験菌株のいずれの処理群においても試験菌株に対する生育阻害作用は観察されなかった.一方,陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において,溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した.なお,コロニー計数時,析出等の特筆すべき変化は観察されなかった.

以上の試験結果から,本試験条件下において,2-(1-メチルエトキシ)エタノールの微生物に対する遺伝子突然変異に関し,陰性と判定した.

なお,本被験物質[2-(1-メチルエトキシ)エタノール]の変異原性に関する報告はなかった.類縁体であるIsopropyl acetateは復帰変異試験で陰性との報告があった3)

Ethylene glycol monomethyl etherは培養細胞を用いたgpt遺伝子突然変異試験で陽性との報告があるが4),McGregorによるレビューでは復帰変異試験を含めた各種遺伝毒性試験で陰性と報告している5).また,ラットを用いたコメット試験では精巣で陽性,骨髄で陰性との報告があった6).Ethylene glycol monomethyl ether acetateは復帰変異試験で弱陽性あるいは疑陽性3),ショウジョウバエを用いた異数性検出試験で陽性7)との報告があった.

Ethylene glycol monobutyl etherは復帰変異試験で陰性3)あるいは陽性8, 9),培養細胞を用いる姉妹染色分体交換試験で陰性10),培養細胞を用いる染色体異常試験で陰性10, 11),培養細胞を用いる遺伝子突然変異試験で陽性12)との報告があった.さらに,マウスならびにラット小核試験で陰性13)との報告があった.吸入暴露でのがん原性試験においてマウスで陽性,ラットで疑陽性との結果が得られている13)

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976).
3)E. Zeiger, B. Anderson, S. Haworth, T. Lawlor, K. Mortelmans, Environ. Mol. Mutagen, 19(suppl 21), 2(1992).
4)H. Ma, J. An, A. W. Hsie, W. W. Au, Mutat. Res., 298, 219(1993).
5)D. McGregor, Occup. Hyg., 2, 213(1996).
6)D. Anderson, A. Dhawan, T. W. Yu, M. J. Plewa, Mutat. Res., 370, 159(1996).
7)C. Osgood, S. Zimmering, J. M. Mason, Mutat. Res., 259, 147(1991).
8)J. C. Hoflack, L. Lambolez, Z. Elias, P. Vasseur, Mutat. Res., 341, 281(1995).
9)B. B, Gollapudi, E. D. Barber, T. E. Lawlor, et al., Mutat. Res., 370(1), 61(1996).
10)National Toxicology Program(NTP), NTP No. 26, NIH Publ, No. 93-3349(1993).
11)Z. Elias, M. C. Daniere, A. M. Marande, O. Poirot, F. Terzetti, O. Schneider, Occup. Hyg., 2, 187(1996).
12)T. Chiewchanwit, W. W. Au, Mutat. Res., 334, 341(1995).
13)National Toxicology Program(NTP), NTP TR 484, NIH Draft Publ, No. 98-3974(1998).

連絡先
試験責任者:中嶋 圓
試験担当者:田中 仁,菊池正憲,赤星まゆみ,尾蛙也
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213 静岡県磐田郡福田町塩新田582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Madoka Nakajima(Study Director)
Jin Tanaka, Masanori Kikuchi, Mayumi Akahoshi, Shinya Ozaki
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393