グリセリン三酢酸エステルの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
Glycerol triacetate on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

グリセリン三酢酸エステルの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)および短時間処理(6時間)のS9 mix非存在下では，ともに2.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度においても50 %を越える細胞増殖抑制は認められなかった．また，短時間処理のS9 mix存在下では50 %細胞増殖抑制濃度が，1.8 mg/mLであったことから，すべての試験において2.2 mg/mLの濃度を最高処理濃度とし，連続処理(24時間および48時間)およびS9 mix非存在下での短時間処理では，公比2で3濃度，短時間処理の S9 mix 存在下では，公比2で4濃度設定した．連続処理では，24時間および48時間処理後，S9 mix存在下および非存在下における短時間処理では6時間処理し，新鮮培地で更に18時間培養後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，すべての系列で最高処理濃度(2.2 mg/mL)であったことから，この濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU細胞を24時間および48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．短時間処理では，S9 mix非存在下で6時間処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．S9 mix存在下では，高濃度群(2.2 mg/mL)において，染色体の構造異常(gapを含む)が誘発された(43.5 %)．また，高濃度群(2.2 mg/mL)では，細胞毒性のために倍数性細胞については規定の細胞数が観察できなかったが，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

グリセリン三酢酸エステルのS9 mix存在下の高濃度(2.2 mg/mL)処理では，培養液が徐々に黄色化し，処理終了後にpHが4.9を示した．従って，本物質の染色体異常誘発に関しては，DNAに対する直接的な傷害作用よりも培養液の酸性化による非生理的な条件によって染色体異常が誘発された可能性が強く，疑陽性と結論した．

方法

1.　使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，牛胎児血清(FCS:Filtron)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬)培養液を用いた．

3.　培養条件

2×10^4個のCHL/IU 細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm，Corning)に播き，37℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目に S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　被験物質

グリセリン三酢酸エステル(ロット番号:N-80302，大八化学工業)は，透明液体で，水に対しては50 mg/mL以上，DMSOでは2 mol/L以上，アセトンでは50 mg/mL以上で溶解し，メタノール，エタノール，トルエン，クロロホルムに可溶であり，分子量218.20，凝固点-62℃，沸点 258℃/760 mmHg，蒸気圧20 mmHg/152℃で，純度98.2 wt%(不純物として Diacetin 0.9 %を含む)の物質である．被験物質原体は，通常の取り扱い条件においては安定である．

5.　被験物質の調製

被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒は DMSO(ロット番号:ESJ4625，和光純薬工業)を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の0.5 vol%になるように加えた．

6.　細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(Monocellater TM，オリンパス光学工業)を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理およびS9 mix非存在下での短時間処理においては2.2 mg/mL(10 mmol/L)でも50 %を越える細胞増殖抑制作用は認められなかったが，S9 mix存在下では，50 %細胞増殖抑制濃度は1.8 mg/mLであった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理，短時間処理ともに 2.2 mg/mL(10 mmol/L)とし，公比2で連続処理およびS9 mix非存在下での短時間処理では3濃度(0.55，1.1，2.2 mg/mL)，S9 mix存在下では4濃度を設定した(0.28，0.55，1.1，2.2 mg/mL)．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，注射用蒸留水(大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験においては1濃度あたり4枚のディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3 %ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，連続処理，短時間処理ともに 2.2 mg/mL(10 mmol/L)が染色体分析の可能な最高濃度であったことから，これらの濃度を含む3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)１）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また，構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法２）により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定３）(p<0.01)を行った．最終的な判定は，統計学的および生物学的な評価に基づいて行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．グリセリン三酢酸エステルを加えて24時間および48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理による染色体分析の結果をTable 2に示した．グリセリン三酢酸エステルを加えてS9 mix非存在下で短時間処理した場合，いずれの処理群でも染色体の構造異常および倍数性細胞は誘発されなかった．S9 mix 存在下では，高濃度群(2.2 mg/mL)において，染色体の構造異常(gapを含む)が誘発され，その頻度は43.5 %であった．また，高濃度群(2.2 mg/mL)では，細胞毒性のために倍数性細胞については規定の細胞数が観察できなかったが，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

グリセリン三酢酸エステルは，S9 mix存在下の高濃度(2.2 mg/mL)処理群においてのみ，培養液の黄色化がみられたことから，処理開始時のpHを6.93に調整して確認試験を実施した．しかしながら，中性域に調整したpHが，処理終了時には4.91までpHが低下しており，培養液のpHを中性域に保つことができなかった．このように，グリセリン三酢酸エステルはS9 mix存在下で培養液を徐々に黄色化させることから，本物質による染色体異常誘発は，DNAに対する直接的な傷害作用よりも培養液の酸性化による非生理的な条件に起因することが考えられ，疑陽性と判断した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988．
2)吉村　功編著，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ," サイエンティスト社，東京，1987．
3)吉村　功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析," 地人書館，東京，1992，pp. 218-223．

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：日下部博一，佐々木澄志，渡辺美香，大嶋節子，井上みゆき，橋本恵子
(財)食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Hirokazu Kusakabe, Kiyoshi Sasaki,
Mika Watanabe, Setsuko Ohshima,
Miyuki Inoue, Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627