4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン)のラットを用いる
反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験

Combined Repeated Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test
of 4,4'-Methylenebis(2-chloroaniline) by Oral Administration in Rats

要約

 4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン)は,主にウレタンエラストマー,ポリウレタンエラストマー,エポキシ樹脂,エポキシウレタン樹脂等の硬化剤に用いられている化学物質である.本物質の毒性について,経口投与におけるLD50値は,マウスで640〜880 mg/kg,ラットで1140〜2100 mg/kgおよびモルモットで400 mg/kg1, 2),また,in vitro復帰変異試験,不定期DNA試験,マウスリンフォーマ試験およびマウス小核試験で陽性,姉妹染色分体交換試験および染色体異常試験で陰性と報告されている3).発がん性試験では,マウスおよびラットで主に肝臓,肺,乳腺などに,また,雌ビーグル犬で膀胱に発がん性の報告がある3).反復投与毒性および生殖・発生毒性に関する報告は見当たらない.

 今回,4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン)について,SD系[Crj:CD(SD)IGS]ラットを用い,0,0.4,2,10および50 mg/kg/day用量で反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験を実施した.動物は1群雌雄各12匹とし,被験物質は交配開始14日前から雄は交配終了後13日間(42日間),雌は分娩後哺育4日(42〜55日間)まで毎日強制経口投与した.

1. 反復投与毒性

 50 mg/kg群における異常値:雌雄に流涎,雌では妊娠後期体重の低値が認められた.血液学検査において雌雄でメトヘモグロビン濃度の増加および赤血球数の減少がみられ,雄において血色素濃度およびヘマトクリット値の減少並びに網状赤血球数および血小板数の増加,雌においてはハインツ小体保有赤血球の増加が認められた.血液生化学検査において雌雄で総タンパクおよびアルブミンの減少がみられ,雄で総コレステロール,トリグリセライドおよび無機リンの増加のほか,雌にはLDHおよびg-GTPの増加並びにA/G比の減少が認められた.器官重量では雄に肝臓の絶対および相対重量並びに脾臓の相対重量の増加が,雌に脾臓の絶対および相対重量並びに肝臓,腎臓,甲状腺の相対重量のいずれも増加が認められ,肝臓においては肉眼的に褪色を示した.病理組織学検査において雌雄に肝細胞腫大(小葉中心性)および肝細胞の脂肪変性(中間帯)が認められたほか,雄では肝細胞の単細胞壊死(中心帯)および腎臓における好塩基性尿細管の増加傾向がみられ,雌雄で脾臓におけるヘモジデリン沈着および髄外造血の増加傾向が認められた.これらの変化は,回復群においてはいずれも回復ないし回復傾向を示し,可逆的な変化であった.

 10 mg/kg群においては,雄で腎臓における好塩基性尿細管および脾臓におけるヘモジデリン沈着の増加傾向が,雌では血清総タンパクおよびアルブミンの減少並びに腎臓の相対重量の増加が認められた.

 以上の結果から,4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン)のラットへの反復投与により,血液毒性を主体とし,脾臓,肝臓,および腎臓に対しても二次的な影響を含め変化が認められた.無影響量(NOEL)は雌雄とも2 mg/kgと推定された.

2. 生殖発生毒性

 親動物の性周期(雌),交尾成立期間,交尾率,受胎率,妊娠期間,黄体数,着床率,出産率,分娩率,分娩および哺育状態に変化は認められなかった.児動物に対しても,総出産児数,新生児数,性比,出生率,体重,形態および哺育4日生存率において,被験物質の投与に起因する変化は認められなかった.

 したがって,雌雄親動物の生殖能および児動物の発生に対する無影響量は,いずれも50 mg/kg/dayと結論された.

方法

1. 被験物質

 4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン)は,水に不溶,アセトンやDMSOに易溶な白色針状粉末結晶である.試験には,イハラケミカル工業(東京)製造のもの(ロット番号FG-3002,純度 99.76 %)を入手し,冷暗所(3〜5℃)密栓下で保管し,使用した.被験物質の投与液は,局方オリブ油[宮澤薬品]を溶媒として,所定の投与用量となる濃度の溶液に調製し,使用時まで冷暗所(3〜5℃)で密栓保管し,調製後7日間以内に使用した.保管条件下および投与形態での被験物質は安定であることを確認した.

2. 供試動物および飼育条件

 日本チャールス・リバー(神奈川)より搬入したSD系[Crj:CD(SD)IGS]ラットを13日間馴化・検疫飼育し,その間に雌については膣垢検査による性周期の確認を行い,異常の認められない動物につき1群雌雄各12匹とし,雌についてはさらに対照群と最高用量群の回復群として各5匹からなる2群の衛星群を設け,10週齢(雄335〜435 g,雌198〜267 g)で試験に供した.なお,雌の回復群については交配を行わなかった.雄の回復群については,投与42日に対照群と最高用量群の中から無作為抽出法によりそれぞれ5匹を選別し,回復群とした.ラットは実測温度 21.2〜24.9℃,実測湿度47〜63 %,換気回数10回以上/時,照明12時間(午前7〜午後7時)の飼育室で,金網ケージ内に個別に収容し,固型飼料[ラボMRストック,日本農産工業]および水を自由に摂取させた.ただし,交尾確認後の雌は,巣作り材料[ホワイトフレーク,日本チャールス・リバー]を入れたポリカーボネート製ケージ内に収容した.

3. 投与量および投与方法

 1群雌雄各1匹のラットに被験物質の500および1000 mg/kgを単回強制経口投与した結果,両用量の雌雄に皮膚・粘膜の蒼白,自発運動低下,眼瞼下垂および体重減少が認められた.1群雌雄各3匹のラットに1,3,10,30および100 mg/kg/dayを14日間反復経口投与した結果,100 mg/kg群で,雌雄に皮膚・粘膜の蒼白,体重増加の抑制,尿の黄色・混濁化,赤血球数,血色素量,ヘマトクリット値,総タンパク,アルブミン,A/G比およびナトリウムの低値,ハインツ小体保有赤血球の出現,血小板数,プロトロンビン時間,GOT,GPT,g-GTP,トリグリセライド,総ビリルビン,カリウム,肝臓重量および脾臓重量の高値のほか,肝臓の退色,脾臓の黒色化,さらに雄で摂餌量の減少,白血球数,LDHの高値,雌に流涎,MCV,MCH,MCHC,活性化部分トロンボプラスチン時間の高値,コリンエステラーゼの低値が認められた.

 以上の結果から,本試験における投与量は50 mg/ kg/ dayを最高用量とし,以下10,2および0.4 mg/kgの計4用量を設定した.投与方法は,投与液量を体重100 g当たり0.5 mLとし,テフロン製胃ゾンデを装着した注射筒を用いて1日1回,交配開始14日前から雄は剖検前日までの42日間,雌では分娩後の哺育4日(42〜55日間)まで,毎日強制経口投与した.対照群には,被験物質の溶媒として用いた局方オリブ油を同様に投与した.

4. 観察および検査

1) 親動物に関する項目

(1) 一般状態観察

 投与期間およびそれに続く14日間の回復期間を通じて,動物の生死,外観,行動等を毎日観察した.

(2) 詳細な臨床観察

 投与開始前日およびその後は週1回,動物をケ−ジから取り出す時およびケージ外のアルミ製オープンフィールド(370 W×560D×40Hmm)で,ケージからの出し易さ,ケージから出す時の扱い易さ,体躯緊張(弛緩〜強直),皮膚(色),毛並み,立毛,眼分泌物,眼瞼閉鎖状態,眼球突出,流涙,口鼻分泌物(汚れ),流涎,下腹部被毛の尿による汚れ,肛門周囲の便による汚れ,発声,呼吸,姿勢,痙攣,振戦,探索行動(覚醒度),警戒性,自発運動(活動性),歩行(よろめき),異常行動(自咬,後ろ向き歩行等),常同(過度の毛繕い,反復旋回運動等),意識不全(混迷,カタレプシー,昏睡),四肢筋緊張度,排尿および排糞の29項目について観察した.

(3) 感覚反射機能検査

 雄は最終投与日,雌は哺育期間中に1回,また回復群の雌雄は最終投与日および回復期間終了日に,聴覚反応,視覚反応,触覚反応,耳介反射,痛覚反応,瞳孔反射,同側屈筋反射,眼瞼反射および正向反射を調べた.

(4) 着地開脚幅,握力および自発運動量測定

 雄は投与41日,雌は哺育期間中に1回,また回復群の雌雄は最終投与日および回復13日に,雄は30分間および60分間,雌は30分間の自発運動量(自発運動量測定装置,SUPERMEX,室町機械),前肢および後肢の握力(ラット・マウス用握力測定装置,MK-380R/FR,室町機械)並びに着地開脚幅を測定した.回復群の雌の自発運動量は,60分間測定した.

(5) 体重および摂餌量測定

 体重の測定は, 投与開始日(投与開始直前)およびその後は7日間隔で行い,さらに最終投与日と屠殺日に測定した.ただし,雌の妊娠後は,妊娠 0,7,14 および 20日と哺育0および4日に測定した.また,回復群については回復7および14日にも測定した.摂餌量は,体重測定日に合わせて翌日までの24時間の飼料消費量を測定した.摂餌量の最終測定日は,雄では投与41日,雌では哺育3日,回復群では回復13日とした.

(6) 性周期検査

 雌について,馴化・検疫期間に引き続き,交尾が確認されるまで,Giemsa染色による膣垢塗抹標本を作製し,鏡検により性周期段階の判定を行った.平均性周期は,角化細胞のみが散在または集塊状にみられる発情後期気回帰する日数の平均値とした.

(7) 交配および分娩状態観察

 投与15日の午後に,雄のケージに同一群内の雌を入れ(1対1),交尾が確認されるまで14日間を限度として連続同居させた.交尾の確認は毎朝一定時刻に行い,膣栓形成あるいは膣垢中に精子が確認された日を妊娠0日とした.分娩状態の観察も同じ時刻に行い,1腹ごとに分娩の終了が確認された日を哺育0日とした.交配および分娩の観察結果から,各群について交尾率[(交尾成立動物数/同居動物数)×100],受胎率[(受胎雌数/交尾成立雌数)×100]および出産率[(生児出産雌数/生存受胎雌数)×100]ならびに分娩が確認された例について妊娠期間(妊娠0日から分娩が確認された日までの日数)を算定した.

(8) 尿検査

 雄について,投与40日および回復群については回復8日に,動物を約3時間代謝ケージに収容し,得られた尿について,外観の観察,試験紙法(マルティスティックス,バイエル・三共)によるpH,潜血,タンパク,糖,ケトン体,ビリルビンおよびウロビリノーゲンの定性的検査並びに沈渣の検査(URI-CELL液,ケンブリッジケミカルプロダクト社,で染色して鏡検)を行った.さらに,18時間収容して得られた尿について,尿量, 比重(屈折計,エルマ光学),ナトリウムおよびカリウム(電解質自動分析装置,NAKL-132,東亜電波工業)を測定した.

(9) 血液学検査

 最終投与の翌日あるいは回復期間終了の翌日の解剖直前に,エーテル麻酔下で開腹して腹大動脈より採血した.動物は前日の午後5時より除餌し,水のみを自由に与えた.採取した血液は3分割し,その一部はEDTA-2 Kで凝固阻止処理し,多項目自動血球計数装置(E-4000,東亜医用電子)により,赤血球数(電気抵抗検出方式),血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法),ヘマトクリット値(パルス検出方式),平均赤血球容積(MCV),平均赤血球血色素量(MCH),平均赤血球血色素濃度(MCHC,以上,計算値),白血球数および血小板数(以上,電気抵抗検出方式)を,また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blue 染色して鏡検),ハインツ小体保有赤血球数(Neutral red brilliant green 染色して鏡検)および白血球百分率(May-Giemsa染色して鏡検)を,さらにメトヘモグロビン濃度(Evelyn- Malloy変法)を測定した.また,血液の一部を3.8 %クエン酸ナトリウム液で凝固阻止処理して血漿を得,血液凝固自動測定装置(KC-10 A,米国アメルング社)により,プロトロンビン時間(Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT,エラヂン酸活性化法)を測定した.

(10) 血液生化学検査

 採取した血液の一部から血清を分離し,生化学自動分析装置(JCA-BM8型クリナライザー,日本電子)により,総タンパク(Biuret法),アルブミン(BCG法),A/G 比(計算値),血糖,総コレステロール,トリグリセライド(以上,酵素法),総ビリルビン(ジアゾ法),尿素窒素(Urease-UV法),クレアチニン(Jaffe法),GOT,GPT,g-GTP,ALP(以上,JSCC法),LDH(SFBC法),コリンエステラーゼ(BTC-DNTB法),カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を,また電解質自動分析装置(NAKL-132,東亜電波工業)により,ナトリウム,カリウムおよび塩素(以上,イオン電極法)を測定した.

(11) 病理学検査

 雄の計画屠殺動物は投与42日の翌日,雌では分娩し哺育も順調であった例は哺育5日に,交尾の成立しなかった例は交配期間終了後24日(投与52日の翌日)に,交尾は成立したが分娩予定の4日後まで分娩が認められなかった例はその翌日に,また, 回復群については回復14日の翌日に,いずれもエ−テル麻酔下で放血屠殺し,体表,開口部粘膜および内部諸器官を肉眼的に観察した.また,各群雌雄各5匹の肝臓,腎臓,副腎,胸腺,脾臓,脳,心臓,下垂体,甲状腺のほか,全ての雄の精嚢並びに全ての雄の精巣および精巣上体を秤量(絶対重量)し,屠殺日の体重に基づいて対体重比(相対重量)を算出した.雌については,卵巣の黄体数および子宮の着床数を調べ,着床率(%)[(着床数/黄体数)×100]を算出した.

 全例について脳,下垂体,甲状腺,胸腺,気管・肺(固定液を注入後浸漬),胃,腸,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,副腎,膀胱,精巣,精巣上体,前立腺,精嚢,卵巣,子宮,脊髄(頸部,胸部,腰部),坐骨神経,骨髄(大腿骨),リンパ節(頸部リンパ節,腸間膜リンパ節),乳腺,その他肉眼的異常部位を採取し,10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液(精巣,精巣上体はブアン液で前固定)にて固定し保存した.病理組織学検査は,対照群および50 mg/kg群の雌雄各5匹のこれら保存器官について実施した.精巣については,精子形成サイクル検査(ステージ供Ν掘き后き擦よび=)を実施した.50 mg/kg群雌雄で被験物質の投与による影響がみられた肝臓および脾臓につき,回復群を含むその他の群の雌雄において検査した.さらに,雄においては腎臓および精巣を,回復群については器官重量に変化が認められた雌の腎臓についても検査した.各群の肉眼的異常部位に関しては全例について検査した.また,交尾不成立の雌雄および交尾は成立したが分娩予定の4日後まで分娩が認められなかった雌については,雄では精巣,精巣上体,前立腺および精嚢を,雌では卵巣,子宮および下垂体を検査した.病理組織学的検査は,常法に従ってパラフィン切片を作製し,H-E染色を施して鏡検した.また,脾臓は色素沈着物を同定するため,全例について鉄(ベルリンブルー)染色を,対照群および50 mg/kg群の雄の各2匹の腎臓についてはPAS染色も行った.

2) 新生児に関する項目

(1) 産児数,性比および外表観察

 分娩完了の確認後,各腹の産児数(生産児と死亡児の合計)を調べ,分娩率[(総出産児数/着床数)×100]を,また,肛門と生殖突起の長短により性別を判定し, 群ごとの性比を算出した.新生児については,口腔内を含む外表の異常を観察した.

(2) 一般状態観察

 毎日一般状態および生死を確認し,出生率[(出産確認時生児数/総出産児数)×100]および新生児生存率[(哺育4日生児数/出産確認時生児数)×100]を求めた.

(3) 体重測定

 新生児について哺育0日および4日に雌雄別に各腹ごとの総体重を測定し,1匹当たりの平均体重を算出した.

(4) 病理学検査

 死亡例はその都度,生存例は哺育4日にエーテル麻酔下で放血死させ,胸部および腹部における主要器官を肉眼的に観察した.

5. 統計処理

 得られた平均値あるいは頻度について,対照群との有意差(危険率5 %以下)を,定量的データおよびパラメトリックデータについて,試験群が3群以上の場合,Bartlettの分散検定を行い, 分散が一様な場合は一元配置の分散分析を行った.分散が一様でない場合およびノンパラメトリックデータは,Kruskal-Wallisの順位検定を行った.それらの結果有意差を認めた場合,DunnettないしDunnett型の検定法による多重比較を行った.試験群が2群間の場合は,パラメトリックデータについてF検定を行い,その結果分散が一様な場合はStudentのt検定を,分散が一様でない場合はAspin-Welchのt検定を行った.また,ノンパラメトリックデータは,Mann-WhitneyのU検定を行った.カテゴリカルデータについては,Fisherの直接確率法を用いて検定した.なお,新生児に関するデータは,1腹を1標本とした.

結果

1. 反復投与毒性

1) 一般状態および死亡

 投与期間中において,流涎が50 mg/kg群で投与8日以降に各12匹中雄の6例と雌の3例に認められた.雌の衛星群の50 mg/kg群にも5匹中3例に流涎が認められた.流涎は概ね投与後10分から30分の間に認められ,投与直後から認められる例もあった.回復期間においては,一般状態の変化は認められなかった.死亡例は,投与期間中および回復期間中を通じて認められなかった.

2) 詳細な臨床観察

 投与前,投与期間中および回復期間中の各時点の観察を通じて,特記すべき異常所見は認められなかった.

3) 感覚反射機能検査

 投与6週および回復2週での検査において,異常所見は認められなかった.

4) 着地開脚幅, 握力および自発運動量

 投与6週および回復2週での検査において,異常所見は認められなかった.

5) 体重(Fig. 1,2)

 投与期間中において,50 mg/kg群で雌の妊娠14日および20日の体重に有意な低値が認められ,妊娠期間中の体重増加量は低値傾向にあった.同群の雌の哺育0日および4日の体重も対照群を下回る傾向にあったが,その間の体重増加量においては対照群と比べ差は認められなかった.雌の衛星群では,対照群をやや下回って推移する傾向にあったものの,有意な変動ではなかった.雄では,体重および体重増加量に変化を認めなかった.回復期間においては,雌雄共に各測定時点の体重および体重増加量に有意な変動を認めなかった.

6) 摂餌量

 投与期間中において,摂餌量に有意な低値が,50 mg/kg 群雄で投与1日に認められた.なお,雌の衛星群で,摂餌量は投与14日および42日に有意な高値を示したが,摂餌量の経時的推移からみて,これらの日の対照群の摂餌量が他の測定日と比べて低値を示したためで,被験物質の投与による影響が示唆されるような変動ではないと判断された.回復期間中においては,有意な変動は認められなかった.

7) 雄の尿検査

 投与期間中および回復期間中の検査において,各検査項目に有意な異常所見は認められなかった.

8) 血液学検査(Table 1)

 投与期間終了時の検査において,50 mg/kg群で雌雄に赤血球数の有意な減少およびメトヘモグロビン濃度の有意な増加,さらに雄には血色素濃度およびヘマトクリット値の有意な減少並びに網状赤血球数および血小板数の有意な増加,雌にはハインツ小体保有赤血球の有意な増加が認められた.また,血色素濃度およびヘマトクリット値の低値傾向並びに網状赤血球数の高値傾向は,50 mg/kg群の雌にも認められた.なお,2 mg/kg群の雌の白血球数は有意な低値を示したが変化に用量相関性が認められず,また背景データにおける正常範囲(38〜113×10^2/μL)の値であったことから,被験物質の投与とは無関係な所見と判断された.回復期間終了時の検査においては,雄の血色素濃度およびヘマトクリット値に有意差が残るものの変化の程度は軽減し,その他の変化は認められなかった.なお,雌のメトヘモグロビン濃度は対照群と比べてやや高値を示し有意差が認められたが正常範囲(0.2〜1.0 %)の値であった.

9) 血液生化学検査(Table 2)

 投与期間終了時の検査において,50 mg/kg群雌雄では総タンパクおよびアルブミンの有意な減少が雌雄に認められ,A/G比では雌で有意な低値, 雄で低値傾向を示した.さらに,雄では総コレステロール,トリグリセライドおよび無機リン,雌ではLDH およびg-GTPのいずれも有意な増加が認められ,雄のLDH およびg-GTPも高値傾向にあった.また,雌雄ともカリウムは高値傾向にあった.なお,被験物質投与各群の雌のコリンエステラーゼは対照群と比べて全般的に低値傾向にあり,0.4,10 および50 mg/kg群に有意差がみられたが変化に用量相関性がなく,いずれも背景データにおける正常範囲(157〜519 IU/L)内の値であったことから,被験物質の投与とは無関係な所見と判断された.回復期間終了時の検査においては,各検査項目に正常範囲を逸脱する異常値はみられなかった.

 10 mg/kg群で雌に総タンパクおよびアルブミンの有意な減少が認められた.

10) 剖検

 投与期間終了時に屠殺した動物のうち,妊娠を成立させた雄において,肝臓の褪色が50 mg/kg群では7匹中6例に認められ,内3例では肝臓の大型化も認められた.分娩し,哺育も順調であった雌においても,肝臓の褪色が50 mg/kg群の10匹中6例に認められ,2例では大型化も認められた.50 mg/kg群の雌雄の肝臓の褪色の発現率には,対照群と比べて有意差が認められた. 50 mg/kg群で認められた妊娠不成立の1対では雌雄に異常は認められず,同群の受胎後胎児死亡(子宮内に浸軟胎児1匹のみ認められた)の認められた1例では肝臓の褪色が認められたが,その他の器官に異常は認められなかった.交尾不成立の対では,10 mg/kg群の1対の雌の子宮に重度な子宮腔水腫が認められたが,2 mg/kg群の1対および10 mg/kg群の他の1対では雌雄とも異常は認められなかった.回復期間終了時の屠殺動物においては,肝臓の変化は認められなかった.なお,被験物質の投与とは無関係に,胸腺の小型化が0.4 mg/kg群の雄の1例,胸腺の赤色域が同群の雌の1例,精巣の小型化が50 mg/kg群の妊娠成立の雄の1例,並びに左側腎臓の大きな白色腫瘤が50 mg/kg群の回復群の雌の1例に認められた.

11) 器官重量(Table 3)

 投与期間終了時屠殺動物のうち,50 mg/kg群では雌に腎臓の相対重量の有意な増加が認められた他,雄では肝臓の絶対および相対重量並びに脾臓の相対重量が,雌では肝臓および甲状腺の相対重量のほか,脾臓の絶対および相対重量が有意な増加を示した.回復期間終了時の屠殺動物においては,雄で脾臓が,雌で肝臓および腎臓の相対重量に有意差が残ったが,変化の程度は軽減する傾向にあり,雄の肝臓,雌の脾臓および甲状腺には変化は認められなかった.なお,回復期間終了時の屠殺動物において雄の精巣に相対重量の有意な高値が認められた.また,10 mg/kg群で雌に腎臓の相対重量の有意な増加が認められた.

12) 病理組織学検査(Table 4, 5)

(1) 生殖器系以外の器官

 被験物質の投与と関連すると思われる変化が,肝臓,脾臓および腎臓に認められた.

a. 肝臓

 50 mg/kg 群で,肝細胞の腫大(小葉中心性)および脂肪変性(中間帯)を特徴とする変化が雄の6匹中6例および雌の8匹中6例に認められた.これらのうち雄の3例では,小葉中心性肝細胞の単細胞壊死も認められた.雌では,これら以外に,脂肪変性のみが明らかな1例が認められた.雌雄の肝細胞の腫大および脂肪変性の発現率には,対照群と比べて有意差が認められた.回復群ではこのような変化は認められなかった.これらの変化以外に,被験物質の投与とは無関係に,微小肉芽腫が各群に,巣状壊死が2 mg/kg群の雌の1例および50 mg/kg群の回復群の雄の1例に,限局性胆管増生が0.4 mg/kg群の雄の1例に認められた.

b. 腎臓

 雄において,軽度な好塩基性尿細管が,各群5匹中,50 mg/kg群では4例,10 mg/kg群では3例認められ,発現率の増加傾向が認められたほか,変化の程度も増強する傾向にあった.しかし,対照群においても1例に認められた.雌には,好塩基性尿細管の増加傾向は認められなかった.回復群では,雄の好塩基性尿細管の発現率は対照群と差は認められなかった.これらの変化以外に,被験物質の投与とは無関係と思われる変化として,近位尿細管上皮の硝子滴が各群の雄の大部分に,孤立性嚢胞および皮質リンパ球浸潤が各群の雌雄に散発的に,また,50 mg/kg群で硝子円柱が雄で1例に,腎芽腫が回復群の雌に1例みられたほか,近位尿細管上皮の好酸性小体が0.4 mg/kg群の雄の1例に認められた.

c. 脾臓

 脾臓の赤脾髄におけるヘモジデリン沈着は,対照群においても雌雄全例に軽度に認められたが,50 mg/kg群の雄の5例および雌の4例には中等度の沈着が認められたほか,10 mg/kg群の雄においても4例に認められ,これら中等度沈着の発生率は有意であった.また,雌の赤脾髄における髄外造血は,50 mg/kg群では4例に中等度の髄外造血の亢進傾向が認められたが,対照群では1例が中等度であったほかは軽度であった.回復群では,雌のヘモジデリン沈着に増加傾向が残ったが,有意差は認められず,雄においてはヘモジデリン沈着および髄外造血の発生は対照群との間に差はみられなかった.

d. その他の器官

 対照群および50 mg/kg群の雌雄ないしはそのいずれかに,肺の泡沫細胞集簇および動脈壁鉱質沈着,心臓の心筋変性・線維化,胸腺の出血などが認められたが,いずれも軽度,かつ,散発的な変化であった.また,剖検時に被験物質の投与とは無関係の所見として,0.4 mg/kg群の雄の1例の小型化した胸腺では胸腺の萎縮が,同群の雌の1例および50 mg/kg群の雄の1例にみられた胸腺の赤色域には出血が認められた.

(2) 生殖器系器官

 被験物質の投与に起因する変化は,認められなかった.妊娠を成立させた対照群および50 mg/kg群の雄において,前立腺間質のリンパ球浸潤が対照群および50 mg/kg群で各5匹中各1例,精巣上体の精子肉芽腫(片側性)が 50 mg/kg群で1例に認められた.また,用量相関性のない精巣の精細管萎縮が0.4 mg/kg群で5匹中2例,2および10 mg/kg群で各4匹中それぞれ1例並びに50 mg/kg群で5匹中2例に認められた.精嚢には変化は認められなかった.また,対照群と50 mg/kg群についての精子形成サイクル検査においても,変化は認められなかった.妊娠し,分娩や哺育も順調であった雌では,卵巣および子宮に変化は認められなかった.

 一方,交尾不成立であった10 mg/kg群の2対では,1対で雄に精巣の精細管萎縮,別の1対で雌に子宮の子宮腔拡張が認められ,子宮の変化は重度であった.また,1対の雌の下垂体にラトケ嚢遺残が認められたが,交尾不成立とは無関係な所見と考えられた.2 mg/kg 群でみられた交尾不成立の1対,および50 mg/kg群で認められた妊娠不成立の1対は,雌雄の生殖器系器官および雌の下垂体には変化を認めなかった.50 mg/kg 群で認められた胎児死亡の雌では,子宮に内膜の好中球浸潤が認められ,卵巣および下垂体には異常を認めなかった.

2. 生殖発生毒性

1) 親動物に及ぼす影響(Table 6)

(1) 性周期検査

 群分けの翌日から交配前までにおいて,全例が4〜5日で発情を回帰し,性周期に有意な変化は認められなかった.

(2) 交尾率および受胎率

 交尾不成立が2 mg/kg群で1対および10 mg/kg群で2対に認められ,交尾率はそれぞれ91.7 %および83.3 %であったが有意差は認められず,変化に用量相関性も認められなかった.その他の群では全例に交尾が成立した.交尾成立までの日数は,50 mg/kg群で有意に長く,特に3対は7日,13日,あるいは14日の長期間を要した.交配中の雌の膣垢検査において,50 mg/kg群の2例では交配開始後2日から発情休止期が持続し,交配開始後12および13日に発情回帰兆候が認められ,それぞれ翌日交尾が成立した.他の1例は,性周期は順調であったが,最初の交配適期に交尾が不成立となり,次の交配適期に交尾が成立したため,交尾まで7日を要した.しかし,これらの3例を除いた場合の交尾成立までの日数には,対照群との間に有意差はなかった.2 mg/kg群の1例および10 mg/kg群の2例についても,交配開始後2日から発情休止期状態となり交配期間終了時まで持続し,交尾不成立となった.これらの雌は,交配前の性周期検査では順調な性周期を示していた.受胎は50 mg/kg群の1例でのみ認められず,受胎率は91.7 %であったが有意差は認められなかった.

(3) 黄体数,着床数および着床率

 50 mg/kg群の黄体数,着床数および着床率は,対照群と比べてやや低値を示したが,これは1例が黄体数:6,着床数:1および着床率16.7 %と低値を示したことによるものであった.しかしながら,対照群と比べていずれも有意差は認められなかった.

(4) 出産率および妊娠期間

 50 mg/kg群の1例にのみ生児の出産が認められず出産率は90.9 %であったが,有意差は認められなかった.妊娠期間にも有意な変化は認められなかった.

(5) 分娩および哺育状態

 50 mg/kg群の1例で分娩が認められなかった以外は,いずれの投与群とも分娩および哺育状態に異常は認められなかった.

2) 新生児に及ぼす影響(Table 7)

(1) 生存性および体重

 一腹当たりの総出産児数,分娩率,哺育0日および4日の新生児数,出生率,性比並びに哺育4日の生存率に有意な変化は認められず,新生児の一般状態にも異常は認められなかった.哺育0日および4日の体重についても,50 mg/kg群でやや低い傾向がみられたものの,いずれも背景データ(哺育0日:雄6.2〜7.4 g,雌5.8〜7.0 g; 哺育4日:雄9.8〜12.0 g,雌9.3〜11.4 g)の範囲内であり,対照群との間に有意差も認められなかった.

(2) 形態

 0.4 mg/kg群で曲尾を呈する出生児が1例(発現率0.5 %)認められた以外は,いずれの群においても外表および内臓異常を有する児動物は認められなかった.内臓変異については,胸腺の頸部遺残が対照群で3例(1.6 %),0.4 mg/kg群で8例(4.4 %),2 mg/kg群で4例(2.5 %)および10 mg/kg群で1例(0.6 %),左臍動脈遺残が2 mg/kg群で2例(1.4 %)および50 mg/kg群で1例(0.7 %),蛇行尿管が対照群で1例(0.6 %)および2 mg/kg群で3例(1.8 %),また,腎盂拡張が10 mg/kg群で1例(0.6 %)認められ,これらの内臓変異を有する児動物は,対照群で4例(2.1 %),0.4 mg/kg群で8例(4.4 %),2 mg/kg群で9例(5.7 %),10 mg/kg群で2例(1.2 %)および50 mg/kg群で1例(0.7 %)であった.これらの内臓変異の発現率には対照群と被験物質投与群との間に有意差はなく,また,用量と相関した増加傾向も認められなかった.

考察

1. 反復投与毒性について

 被験物質の投与による影響が,主に血液成分に対してみられ,その二次的影響を含め,脾臓,肝臓および腎臓にも認められた.

 血液に対する影響について,50 mg/kg群で雌雄に赤血球数,血色素濃度およびヘマトクリット値の減少傾向が認められた.また,これらの貧血所見に加えて,50 mg/kg群で血小板数の増加が認められた.病理組織学検査では,脾臓に雌雄供にヘモジデリン沈着の増加が,さらに雌では髄外造血の亢進が認められ,これらは赤血球の破壊亢進およびそれによる貧血並びに貧血に対する代償性の造血亢進の結果と考えられる.50 mg/kg 群の雌雄で認められた脾臓の重量変化は,これらの病理組織学的変化を反映したものと思われる.また,50 mg/kg群の雌雄に認められたカリウムや網状赤血球の増加傾向も,それぞれ赤血球の破壊亢進および造血亢進を示唆する変化で, 雌雄にメトヘモグロビン濃度,雌にハインツ小体保有赤血球のいずれも増加傾向が認められていることを考慮すると,本試験で認められた貧血は,メトヘモグロビン血症に伴う溶血性貧血が主病因と考えられる.このようなメトヘモグロビン血症に伴う溶血性貧血は,アミノフェノール類,N-ヒドロキシアリルアミン類,亜硝酸アミル,および他の脂肪族亜硝酸塩または脂肪族硝酸塩などで発現することが知られている4).

 さらに,10 mg/kg群でも,雄に脾臓のヘモジデリン沈着増加のみが認められ,貧血所見は明らかでなかったが,10 mg/kg群においても被験物質の血液に対する影響が軽度に発現していることが示唆された.

 肝臓に対する影響について,50 mg/kg群で雄に肝臓の絶対および相対重量,雌で相対重量の増加が認められ,肉眼的には肝臓の退色が認められた.病理組織学検査では,同群の雌雄の肝臓に肝細胞腫大(小葉中心性)および脂肪変性(中間帯)が認められ,雄では小葉中心帯肝細胞の単細胞壊死を伴う例も認められた.血液生化学検査で50 mg/kg 群の雌雄に認められた総タンパク,アルブミンおよび A/G比の低値傾向並びにLDHおよびg-GTPの高値傾向,雄に認められた総コレステロールおよびトリグリセライドの高値傾向も,肝機能に対する影響と関連する所見と考えられ,貧血および循環障害による肝血流量の低下を反映したものと考えられる.また,10 mg/kg群では雌に総タンパクおよびアルブミンの低値傾向が認められており,肝臓に対する影響が軽度に発現しているものと判断された.

 腎臓に対する影響に関して,10 mg/kg群および50 mg/kg群で雌に病理組織学的変化や,血液生化学的変化で腎機能異常を示唆する変化を伴わない腎臓の相対重量増加が認められた.一方,雄では10および50 mg/kg群で好塩基性尿細管の増加傾向が認められたが,障害された尿細管の再生像と思われた.その他,50 mg/kg群雄に認められた無機リンの高値は,腎機能に対する影響に関連する変動と考えられた.

 これらの変化に加えて,50 mg/kg群で雌雄に流涎,雌に妊娠後期の体重の低値および甲状腺相対重量の高値が認められた.

 流涎について,詳細な臨床観察,感覚反射機能検査,着地開脚幅,握力,自発運動量等において,神経行動毒性を示唆する変化は認められなかったこと,流涎が概ね投与後10分から30分の間に認められ,投与直後から認められる例もあったことから,投与液の味に対する反射的反応の可能性も考えられる.

 また,甲状腺相対重量の高値について,病理組織学検査において被験物質の投与による変化は認められず,また絶対重量には変動が認められないことから,毒性学的意義はないものと思われる.

 このような被験物質の投与による影響は,回復群において回復ないし回復傾向が認められたことから,可逆的な変化であると判断された.

 なお,回復群の雄に精巣相対重量の高値が認められたが,病理組織学検査では被験物質の投与と関連した変化は認められず,毒性影響を示唆する変動ではないと考えられた.また,回復群の雌の1例に腎臓の腎芽腫が認められた.本腫瘍は後腎原基由来上皮の胎児性腫瘍で,ラットに自然発生的に認められ5, 6),1例のみの発現であったことから,被験物質の投与とは無関係な所見と判断された.

 以上の結果から,親動物における反復投与による無影響量(NOEL)は雌雄ともに2 mg/kg/dayと推定された.

2. 生殖発生毒性について

 親動物において,観察した各指標では,いずれも対照群と比べて有意な変化は認められず,生殖系器官にも被験物質投与に起因する病理学的変化は認められなかった.

 なお,交尾不成立が2 mg/kg群で1対および10 mg/kg群で2対に認められ,また,交尾成立までに長期間を要した3対が50 mg/kg群で認められた.これらの雌雄について,病理組織学検査では交尾不成立に関連すると考えられる異常は認められず,性周期検査の結果から,雌が偽妊娠を起こしたことによるものと判断された.

 50 mg/kg群で,雌の1例については分娩が認められず,浸軟胎児が子宮内に1例のみ認められた例では,子宮内膜に炎症性反応が認められ,これが胎児発育および分娩に影響を及ぼしたものと考えられる.この例は,排卵数(黄体数)が少なく,着床数は1個であったが,卵巣や下垂体など他の臓器に異常は認められなかった.

 児動物に対しては,発生・発育に関する各指標において被験物質の投与による影響は認められなかった.対照群を含む各投与群で少数例の外表異常および内臓変異がみられたが,いずれも自然発生的に認められるもので7),発現率に有意差および用量相関性もないことから催奇形性を示唆する変化ではないと判断された.

 以上の結果から,雌雄親動物の生殖能および児動物の発生に対する無影響量はいずれも50 mg/kg/dayと結論された.

文献

1) Registry of Toxic Effects of Chemical Substances (RTECS), US NIOSH(1998).
2) Richardson ML, Gangolliet S:In メThe Dictionary of Substances and their Effectsモ, Volume 3, The Royal Society of Chemistry, England(1994)pp.293-295.
3) IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 57 (1993).
4) Kiese, M.:Methemoglobinemia, A Comprehensive Treatise. CRC Press, Cleveland(1974).
5) 日本毒性病理学会(編):「毒性病理組織学」アイペック,東京(2000)p.258.
6) Charles A. Montgomery, Jr., John Curtis Seely: Kidney, Hyperplastic and Neoplastic Lesions, Other Neoplasms:Nephroblastoma, In メPathology of the Fischer Ratモ, Academic Press, Inc., San Diego (1990)p.143.
7) Morita H, et al.:Spontaneous malformations in laboratory animals, Frequency of external, internal and skeletal malformations in rats, rabbits and mice. Cong. Anom., 27:147-206(1987).

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