2-ビニルピリジンのラットを用いる
28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
2-Vinylpyridine in Rats

要約

2-ビニルピリジンは,タイヤコード接着剤材料および医薬用原料として使用されている化合物である.本化合物は腐食剤および催涙剤であり,嚥下,吸入あるいは経皮吸収されると有害であることが知られている1).また,粘膜,上気道,眼および皮膚の組織に対しきわめて破壊的であることも報告されている1).今回,既存化学物質の安全点検に関わる毒性調査事業の一環として,2-ビニルピリジンについてSD系のラットを用い,12.5,50および200 mg/kg/dayの用量で28日間反復経口投与毒性試験を実施した.なお,対照群および200 mg/kg群にはそれぞれ雌雄各5匹の14日間回復群を設けた.

一般状態の観察では,雌雄の200 mg/kg群で,口の周囲から下顎部を濡らす程度の流涎が認められ,さらに下顎部の被毛の汚れが認められた.また,雌雄の50 mg/kg群においても,口の周囲を濡らす程度の流涎が認められた.これらの症状は,50 mg/kg群では投与5時間以内に,200 mg/kg群では翌日の投与前までに消失する繰り返しであった.投与期間に観察された上述の症状は,回復試験では観察されず,症状の回復が認められた.なお,雌雄いずれの群にも死亡例は観察されなかった.

体重は,雄の200 mg/kg群で投与2,3および4週に増加が抑制され,摂餌量は,同群で投与2週に減少が認められた.回復試験では,これらはいずれも回復が認められた.

血液学的検査,血液凝固能検査および血液生化学検査の結果,雌雄とも被験物質投与と関連づけられる変化は認められなかった.

尿検査の結果,雌では200 mg/kg群で尿量の増加および比重の低値が認められ,50 mg/kg群で比重の低値が認められた.回復期間終了時では,これらはいずれも回復が認められた.

器官重量測定の結果,雄では200 mg/kg群で精巣相対重量の高値,雌では200 mg/kg群で脾臓実重量および相対重量の低値ならびに肝臓相対重量の高値が認められた.回復期間終了時では,これらはいずれも回復した.

病理学検査の結果,肉眼所見では前胃の粘膜肥厚が雌雄ともに200 mg/kg群で全例に観察された.組織所見では前胃の扁平上皮増生が200 mg/kg群の雌雄の全例と50 mg/kg群の雌雄の3例に観察された.さらに前胃では粘膜下の浮腫,びらんや細胞浸潤,腺胃では粘膜下の浮腫やびらんなどの所見も一部の例に観察された.回復終了時計画解剖動物においても,組織所見で200 mg/kg群の雌雄で前胃の扁平上皮増生が軽度ながら観察されたが発生数や程度も軽減しており可逆性の変化と考えられた.

以上のことから,本試験では雌雄の50および200 mg/kg群で認められた一般状態の変化および病理学検査における胃の異常病変が被験物質投与と関連づけられるものであり,被験物質の標的器官は胃と判断された.また,無影響量(NOEL)は雌雄ともに一般状態の変化および胃の異常病変が認められなかった12.5 mg/kg/dayと判断された.

方法

1.被験物質

2-ビニルピリジン(有機合成薬品工業(株)提供)は特異臭のある淡黄色の油溶性液体で,分子式C7H7N,分子量105.15の化合物である.本試験に用いたロット95-022の純度は98.3%であった.

2.供試動物

供試したラット〔Crj:CD(SD)系,SPF〕は日本チャールス・リバー(株)から4週齢で購入した.動物を検収後,試験環境に8日間馴化させた後,6週齢で投与を開始した.動物はあらかじめ体重によって層別化し,無作為抽出法により各試験群を構成するように群分けした.投与開始時の体重は雄で123〜137 g,雌で107〜116gであった.

3.飼育条件

動物はバリアシステムの飼育室で飼育し,環境調節の目標値は温度23±2℃,相対湿度55±10%,換気回数20回/時,照明150〜300 lux,12時間(午前7時点灯,午後7時消灯)とした.(株)東京技研サービスの水洗式飼育機を使用し,金属製前面・床網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容し,オリエンタル酵母工業(株)製造の放射線滅菌改良NIH公開ラット・マウス飼料および水道水を自由に摂取させた.飼育ケージは隔週1回,給餌器は週1回取り換えた.

なお,動物の馴化期間を含め,投与および回復期間中,データの信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因の変化はなかった.

4.試験群の構成

試験群は0,12.5,50および200 mg/kgの4群とし,1群雌雄各5匹を用い,0および200 mg/kg群に雌雄各5匹の回復群を設け,計60匹を使用した.

〔用量設定理由〕

投与量設定のための2週間反復投与試験を0,30,90および270 mg/kgの4用量で実施した.その結果,270 mg/kg群では一般状態の変化として,雌雄全例に被毛を汚す程度の流涎が認められ,さらに一部の例に驚愕反射が観察された.また,体重は雄で増加抑制が認められ,血液学的検査では雌雄で好中球比率の増加,血液生化学的検査では雄でGOTの高値および総コレステロールの低値,雌でGPTの高値が認められた.器官重量測定では,雌雄ともに270 mg/kg群で副腎が高値を示し,胸腺が低値を示した.病理肉眼観察では,270 mg/kgおよび90 mg/kg群の雌雄で前胃粘膜の肥厚が認められ,さらに270 mg/kg群の雌雄には胃と周囲組織の癒着および前胃の潰瘍も認められた.

以上の結果,270 mg/kgでは雌雄ともに重篤な影響が認められたことから,28日間反復投与毒性試験の高用量は,これよりやや低い用量が適切と考え200 mg/kgを設定し,以下公比4で除し中用量を50 mg/kg,低用量を12.5 mg/kgとした.

5.投与方法

被験物質はコーン油に溶解し,胃ゾンデを用いて経口投与した.投与容量は体重100 g当たり0.5 mlとした.対照群には媒体のみ投与した.

6.投与液の調製,分析

被験物質は,各用量ごとに所定量を精秤し,コーン油(ナカライテスク(株))に溶解した.投与液は調製後,冷蔵庫保存で1週間安定であることが確認されているので,本試験においては毎週1回調製を行い,1日分毎に小分けをし使用時まで冷蔵庫に保管した.投与液の濃度分析をすべての群に関し投与1および4週の調製液について実施した結果,設定濃度の100〜105%の範囲であり,適切に調製されていた.

7.投与期間

投与期間は28日間とし,投与終了後0および200 mg/kg群について2週間の回復試験を実施した.

8.観察,測定および検査

1) 一般状態の観察

全動物を毎日投与前,投与後1および5時間の3回観察し,中毒症状の有無,行動異常,死期の迫った動物および死亡動物の有無等を記録した.

2) 体重

投与開始から回復試験終了時まで,毎週1回測定した.

3) 摂餌量

毎週1週給餌した残量を測定し,飼料摂取量(g/week)を算出した.

4) 臨床検査

投与終了時および回復期間終了時の計2回実施した.採血するに当たり,動物は約16時間絶食させた.動物をエーテルで麻酔後開腹し,腹部大動脈から採血した.

a.血液学的検査

EDTA-3Kを添加した初血を用い,白血球数(WBC:暗視野板法),赤血球数(RBC:暗視野板法),ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法),ヘマトクリット値(HCT:RBC,MCVより算出),平均赤血球容積(MCV:暗視野板法),平均赤血球血色素量(MCH:HGB,RBCより算出),平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB,HCTより算出),血小板数(PLT:暗視野板法)および白血球百分率(フローサイトケミストリー法)を血液自動分析装置THMS H・1E(米国マイルス社)を用いて測定した.

網赤血球(RC)率算定用のため抗凝固剤添加(EDTA-3K)血液をニューメチレンブルーで染色後,塗抹標本を作成し鏡検した.

また,クエン酸ソーダ添加血液の血漿について,プロトロンビン時間(Quick1段法),活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)およびフィブリノーゲン量(トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)を用いて測定した.

b.血液生化学検査

血清を用いて,総蛋白(ビューレット法),アルブミン(B.C.G.法),A/G比(計算値),血糖(グルコースオキシダーゼ法),中性脂肪(酵素比色法),総コレステロール(コレステロールオキシダーゼ法),尿素窒素(BUN:ウレアーゼアンモニア指示薬法),総ビリルビン(ジアゾ法),カルシウム(アルセナゾ桂),無機リン(モリブデン酸青法),ナトリウム(電極法),カリウム(電極法)および塩素(電極法)をEKTACHEM 700N(米国コダック社)で,クレアチニン(Jaff法),グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT:IFCC法),グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT:IFCC法),γ -グルタミルトランスペプチダーゼ(γ -GTP:Orlwski法)およびアルカリホスファターゼ(ALP:Bessey-Lowry改良法)をCentrifiChem ENCORE(米国ベーカー社)で測定した.

c.尿検査

血液学的検査に先立ち,採尿器を用いて24時間(午前10時から翌日午前10時まで)尿を採取し,尿量,色調および濁度を検査後,尿比重計UR-S((株)アタゴ)を用いて尿比重を測定した.また,尿を遠心分離後Sternheimer変法により沈渣を染色し,鏡検した.pH,潜血,ケトン体,糖,蛋白,ビリルビンおよびウロビリノーゲンの検査は,排泄3時間以内の新鮮尿について,N-マルティスティックスSG試験紙(マイルス・三共(株))およびCLINITEK200(米国マイルス社)を用いて行った.

5) 病理学検査

病理解剖は投与終了時および回復期間終了時に動物をエーテル麻酔し,放血致死させ実施した.また,脳,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,精巣,卵巣および胸腺について重量を測定し,器官重量・体重比を算出した.

病理組織学検査は,投与終了時に解剖した対照群および200 mg/kg群の胃,十二指腸,胸腺,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,副腎および骨髄(大腿骨)について検索した.なお,胃については高用量群で変化が認められたため,中間用量および回復群についても検索した.常法に従って薄切標本を作製し,ヘマトキシリン・エオジン染色し鏡検した.

6) 統計解析

各試験群の体重,摂餌量,血液学的検査値,血液生化学検査値,尿検査値(尿量および尿比重のみ),器官重量および器官重量・体重比については,多重比較検定2, 3)を行った.また,病理学検査結果についてはFisherの確率計算法を実施した.

有意水準は5および1%の両側検定で実施した.

結果

1.死亡率

投与期間中および回復期間中,雌雄とも対照群を含むすべての試験群で死亡例は認められなかった.

2.一般状態の観察

雄では200 mg/kg群で,投与7日から10例中3例に口の周囲を濡らす程度の流涎が認められ,さらに投与8日には1例に軽度の自発運動低下が認められた.また,投与11日から1例に下顎部の被毛の汚れが認められた.これらの症状のうち,流涎は投与14日には10例全例に増加し,下顎部に達した例が同日に2例,投与24日には4例に認められた.また,被毛の汚れは投与24日には4例に増加した.50 mg/kg群では,投与21日から5例全例に口の周囲を濡らす程度の流涎が認められた.

雌では200 mg/kg群で,投与10日から10例中1例に口の周囲を濡らす程度の流涎が認められ,投与15日から全例に増加した.流涎は,投与18日に下顎部に達した例が10例中4例認められ,投与19日以降には1から3例に認められた.また,投与18日には4例に下顎部の被毛の汚れが認められた.50 mg/kg群では投与21日から5例全例に口の周囲を濡らす程度の流涎が認められた.

なお,雌雄で認められた上述の症状は,いずれも投与後1時間以内から発現し,50 mg/kg群では投与後5時間以内に,200 mg/kg群では投与翌日の投与前までに消失する繰り返しであった.回復期間中,雌雄の200 mg/kg群で異常は認められなかった.

その他,雄では対照群で投与13日から10例中1例に,さらに回復14日においても5例中1例に軽度の頸部または前肢の外傷が,また50 mg/kg群では投与28日に1例で軽度の歯の異常が観察されたが,これらはいずれも用量に対応した症状ではなかった.

3.体重(Figure 1)

雄では200 mg/kg群で,投与2週以降に体重増加抑制が認められ,投与終了時の平均体重は対照群に比較して11.9%減少した.回復期間に入ると,回復傾向が明確に認められ,対照群より体重増加量は大であった.

雌では投与期間に群間で差が認められなかった.回復1週に対照群に比較して200 mg/kg群で低値が認められたが,投与終了時の解剖で,対照群において偶発的に体重の小さな個体が解剖されたための変化であった.

4.摂餌量

雄では,対照群に比較して200 mg/kg群で投与2週に摂餌量の減少が認められたが,投与4週までの総摂餌量に差は認められなかった.回復期間中に対照群と200 mg/kg群で明確な差は認められなかった.

雌では,投与期間中および回復期間中に,対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.

5.血液学的検査(Table 1)

〔投与終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

〔回復期間終了時の検査結果〕

雄では,対照群に比較して200 mg/kg群で網赤血球率の高値が,雌では200 mg/kg群でMCHCの低値が認められたが,網赤血球率の高値は背景値(背景値32±9,n=30)の正常範囲内の値であり,MCHCの低値は,算出のもととなったMCVおよびMCHに対照群との差は認められず,意義のある変化ではなかった.

6.血液凝固能検査(Table 1)

投与および回復期間終了時のいずれにおいても,雌雄ともに対照群と被験物質投与群とで検査を行った3項目に差は認められなかった.

7.血液生化学検査(Table 2)

〔投与終了時の検査結果〕

対照群に比較して,雌では200 mg/kg群でクレアチニンの低値が認められた.なお,200 mg/kg群では雌雄ともに中性脂肪の低値傾向およびGPTの高値傾向が認められ,さらに雄ではγ -GTPの高値傾向が,雌ではアルカリフォスファターゼの高値傾向が認められたが,これらはいずれも統計学的には有意な変化ではなかった.上述の雄にみられたγ -GTPの変化は,1例の高値によるものであり,さらにその1例はGPTの高値も伴っていた.また,雌にみられたアルカリフォスファターゼの変化も1例の高値によるものであり,さらにその1例は中性脂肪の低値も伴っていた.

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

8.尿検査(Table 3)

〔投与終了時の検査結果〕

雌では,対照群に比較して200 mg/kg群で尿量の増加および比重の低値が認められ,さらに50 mg/kg群で比重の低値が認められた.雄では,対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった.

9.器官重量(Table 4)

〔投与終了時の検査結果〕

雌では,対照群に比較して200 mg/kg群で脾臓重量の低値が認められ,50 mg/kg群で卵巣および腎臓重量の高値が認められた.なお,雄では,対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

10.器官重量・体重比(相対重量)(Table 4)

〔投与終了時の検査結果〕

対照群に比較して,雄では200 mg/kg群で精巣相対重量の高値が認められ,雌では,すべての被験物質投与群で脾臓相対重量の低値が認められ,さらに200 mg/kg群で肝臓相対重量の高値が認められた.

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とで差は認められなかった.

11.病理学検査

a) 剖検所見(Table 5)

〔投与終了時計画解剖動物〕

被験物質投与の影響と考えられる病変として200 mg/kg群で前胃の粘膜肥厚が雌雄の5例全例に観察された.また統計学的な有意差はないが同群では前胃の潰瘍が雌雄各1例に観察されたほか,腺胃の黒色斑点/区域が雌の1例に観察された.その他,被験物質投与に関連する病変は認められなかった.

〔回復試験終了時計画解剖動物〕

対照群に比較して被験物質投与群に多くみられた病変は観察されなかった.観察された病変はいずれも単発性の発生であった.

b) 組織所見(Table 6)

〔投与終了時計画解剖動物〕

被験物質投与の影響と考えられる病変として,前胃の扁平上皮増生が200 mg/kg群の雌雄の全例(中程度)と50 mg/kg群の雌雄の3例(軽度)に観察された.さらに統計学的な有意差はないが前胃粘膜下の浮腫が200 mg/kg群の雄の2例,雌の3例と50 mg/kg群の雌雄の1例に観察されたほか,びらんや細胞浸潤も200 mg/kg群の雄の1例に観察された.腺胃では粘膜下の浮腫が雌の200 mg/kg群の3例と50 mg/kg群の1例に,びらんが200 mg/kg群の1例にそれぞれ観察された.

その他,肝臓の小肉芽腫や腎臓の尿細管好塩基化などの所見が観察されたが対照群と被験物質投与群で発生数に有意な差は認められなかった.

〔回復試験終了時計画解剖動物〕

被験物質投与群(200 mg/kg群)では前胃の扁平上皮増生が軽度ながら雄の3例と雌の2例に観察された.

考察

一般状態の観察では,雌雄の50および200 mg/kg群で流涎が投与後1時間以内から発現し,50 mg/kg群では投与後5時間以内に,200 mg/kg群では翌日の投与前までに回復が認められ,被験物質投与による影響と考えられた.また,被験物質は腐食剤および催涙剤としても知られており,観察された流涎は被験物質による消化管粘膜の刺激によるものと考えられた.

体重および摂餌量は,雄の200 mg/kg群で投与期間中に低値または減少が認められたが,いずれの変化も回復期間中には回復が認められた.

血液学的検査および血液凝固検査の結果,被験物質投与によると考えられる変化は雌雄いずれの群にも認められなかった.

血液生化学検査の結果,200 mg/kg群では,雌雄ともに中性脂肪の低値傾向およびGPTの高値傾向が認められ,さらに雌ではクレアチニンの低値が認められたが,病理学検査の結果からはこれらの変化を示唆する明らかな異常は認められず,毒性学的意義は乏しいと考えられる.なお,200 mg/kg群の雄で認められたγ -GTPおよび雌で認められたアルカリフォスファターゼの変化は,それぞれ1例の高値による高値傾向であることから,これらはともに被験物質投与による可能性は低いと考えられる.

尿検査の結果,雌では200 mg/kg群で尿量の増加および比重の低値が認められ,さらに50 mg/kg群で比重の低値が認められた.被験物質を2週間投与した予備試験では,胃の粘膜に潰瘍等の障害が認められていることから,粘膜への直接刺激を緩和するために大量の水を摂取し,尿量が増加したものと考えられた.

器官重量測定の結果,雄の200 mg/kg群で認められた精巣相対重量の高値,雌の200 mg/kg群で認められた脾臓実重量および相対重量の低値ならびに肝臓相対重量の高値は,いずれも被験物質投与による影響と考えられたが,病理組織学検査の結果からこれらの器官に異常は認められなかった.また,雌の12.5および50 mg/kg群で認められた脾臓相対重量の低値は,投与終了時における雌の対照群の重量が回復期間終了時における重量と等しく,比較した対照群が高値傾向にあったために生じたものと考えられ,被験物質の影響とは判断されなかった.その他,変化のみられた卵巣および腎臓は,用量に対応した変化ではないことから,被験物質投与による変化ではないと考えられた.回復期間終了時では,脾臓,肝臓および精巣に異常は認められず回復がみられた.

病理学検査の結果,被験物質の影響が示唆される病変として,肉眼所見では胃(前胃)の粘膜肥厚が雌雄ともに200 mg/kg群で全例に観察された.この病変に対応する組織所見として前胃の扁平上皮増生が200 mg/kg群の雌雄の全例(中程度)と50 mg/kg群の雌雄の3例(軽度)に観察された.さらに前胃では粘膜下の浮腫,びらんや細胞浸潤,腺胃では粘膜下の浮腫やびらんなどの所見も一部の例に観察された.これらの変化はいずれも,2-ビニルピリジンの持つ刺激性や腐食性から考え被験物質の胃への直接的な作用と考えられた.これらの変化の内,前胃の扁平上皮増生は回復終了時の動物にも観察された.しかし,発生数や程度も軽減しており可逆性の変化と考えられた.

以上のことから,本試験では雌雄の50および200 mg/kg群で認められた一般状態の変化および病理学検査における胃の異常病変が被験物質投与と関連づけられるものであり,被験物質の標的器官は胃と判断された.また,無影響量は雌雄ともに一般状態の変化および胃の異常病変が認められなかった12.5 mg/kg/dayと判断された.

文献

1)"The Sigma-Aldrich library of Chemical Safety data", edition, Vol.2, ed. by R.E.Lenga, U.S.A., 1988, p.3606.
2)佐野正樹,岡山佳弘,医薬安全性研究会会報,32,21(1990).
3)M. Yoshida, J.J. Soc. comp. Stat., 1, 111(1988).
連絡先
試験責任者:大庭耕輔
試験担当者:各務 進,庄子明徳,渡 修明,岩田 聖
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Authors:Kousuke Oba(Study director)
Susumu Kakamu,Akinori Shoji, Nobuaki Watari,Hijiri Iwata
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden Aza Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan
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